Μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας των βακτηρίων τεχνητής λίμνης: ποιοτική και ποσοτική εποχιακή διακύμανση των μικροβιακών πληθυσμών

Abstract

The supply of safe drinking water is one of the challenges that most countries have to face in nowadays, due to the growing numbers of human population and to the industrialization. In E.U., 20% of surface waters are menaced by pollution and degradation, while the water demands exceed the available water sources. The study of microbial diversity of freshwater environment consist an inextricable research field for the management of freshwater, which is related to the water quality control and the public health, and therefore it should be a priority concern for society. On the other hand, the degradation of most aquatic systems, including lakes and reservoirs, mostly because of anthropogenic interventions, consist a huge ecological issue which attracts major scientific concern, by posing supplementary concerns on the appropriateness of water for human consumption. In this study, the priority goal was to record the microbial diversity (cultured and uncultured prokaryotes) in the drinking water reservoir of Lake Marathonas and the seasonal fluctuation of microbial communities, using cloning and DGGE methods, in order to analyze and estimate any potential danger, in a spatiotemporal level. The monitoring of the microbial content consist a prerequisite for both the prevention of any potential danger and the development of new isolation methods. The above needs are driven vigorously by the lack of cultivating techniques in a wide range of potential pathogens. However, knowing that the approaches used the past 100 years for routine controls of drinking water rely mainly on the detection of the coliform bacteria group as well as E. coli, which represent the most common microbial indicators, the present study included also standard cultivation methods on selective and diagnostic media along with the development of culture-independent techniques, such as: a) PCR for the detection of E. coli, coliform bacteria, Enterococcus sp. and Salmonella sp., b) FISH for rapid recognition of different microbial groups and c) the comparison of standard techniques (multiple tube fermentation, membrane filtration technique) and biochemical methods (ß-D-galactosidase and ß-D- glycouronidase activities). The results demonstrated that the microbial dynamics in the Marathonas Reservoir is quite stable but widely different in each sampling site in terms of both diversity and richness. Based on the cloning procedure results, Actinobacteria seem to represent the dominant bacterial group in the reservoir. However, bacteria in the lake seem to be equally distributed in the groups of a- and β-Proteobacteria and to a lesser extent to γ-Proteobacteria, whose representatives are more common when cultivation techniques are applied. The Bacteroidetes group also consist an important phylum detected in the lake, while representatives of Acidobacteria, Chloroflexi and the recently characterized group of Verrucomicrobia were also retrieved. Another important finding of this study is the presence of cyanobacterial clones on a regular spatiotemporal basis, in all four sampling sites, including potentially toxic clones of the genus Microcystis. Roughly speaking, the cyanobacterial content of the lake seems to be directly related to the retention time in the lake. On the other hand, the application of standard cultivation techniques on water samples, in order to estimate the extent of the microbial contamination in the reservoir, exhibited serious disadvantages such as the lack of specialization in the retrieval of certain pathogens, the relatively low number of selective media available and the proportionally high detection limits of the indicator organisms. However, the confirmation of the hypothesis that enterococci seem to correlate better with gastrointestinal events and that they probably represent a better indicator of fecal contamination in the water than E. coli and mainly than the coliforms was confirmed and therefore they can be used at least on a supplementary basis in routine controls. Nevertheless, standard techniques bear certain disadvantages and molecular techniques demand further improvement. In particular, the application of PCR directly on water samples may give falsely positive results due to either the presence of certain microbial groups in very low frequencies or to the detection limit of the method itself or even and more commonly to the lack of specialization of primers used to distinguish between closely related bacteria (e g. coliforms and E. coli). Finally, FISH might be efficient enough to give more credible and supplementary to PCR also qualitative results. However, certain disadvantages such as its high detection limits and the time consuming elaboration of samples should be considered, especially when enrichment cultures should be applied in samples of very low content of certain pathogens (e.g. Salmonella sp.).

Η παροχή ασφαλούς πόσιμου νερού είναι μία από τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουν οι περισσότερες χώρες, ως αποτέλεσμα του αυξανόμενου πληθυσμού και της βιομηχανοποίησης. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση, το 20% των επιφανειακών υδάτων απειλείται από ρύπανση και υποβάθμιση, ενώ παράλληλα η ζήτηση σε νερό υπερβαίνει τους διαθέσιμους υδάτινους πόρους. Η μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας του περιβάλλοντος του γλυκού νερού αποτελεί προϋπόθεση για τη διαχείρισή του. Η διαχείριση αυτή συνίσταται στον έλεγχο της ποιότητάς του και σχετίζεται με τη δημόσια υγεία, άρα αφορά τελικά άμεσα την ίδια την κοινωνία. Επιπρόσθετα, η υποβάθμιση των περισσότερων υδάτινων συστημάτων, συμπεριλαμβανομένων των λιμνών και των ταμιευτήρων, εξαιτίας κυρίως ανθρωπογενών παρεμβάσεων, αποτελεί τεράστιο οικολογικό ζήτημα που ελκύει έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον, θέτοντας επιπρόσθετες ανησυχίες ως προς την καταλληλότητά του νερού για ανθρώπινη κατανάλωση. Στην παρούσα μελέτη, ο πρωταρχικός στόχος ήταν η καταγραφή της μικροβιακής ποικιλότητας (καλλιεργήσιμοί και μη βακτηρίων) στον ταμιευτήρα πόσιμου νερού της Λίμνης του Μαραθώνα και της εποχιακής διακύμανσης των πληθυσμών των βακτηρίων, με τη μέθοδο της κλωνοποίησης και της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα ακρυλαμίδης παρουσία αποδιατακτικού παράγοντα (DGGE), με στόχο την ανάλυση και την εκτίμηση του πιθανού κινδύνου, σε επίπεδο χρονικό και τοπικό. Η παρακολούθηση του μικροβιακού δυναμικού του ταμιευτήρα αποτελεί προϋπόθεση για την πρόληψη κινδύνων και την ανάπτυξη νέων μεθόδων απομόνωσης μικροοργανισμών. Δεδομένου μάλιστα του περιορισμού, ως προς το εύρος των ελεγχόμενων μικροοργανισμών, που επιτρέπουν οι καθιερωμένες τεχνικές, η αναγκαιότητα αυτή κρίνεται επιτακτική. Η προσέγγιση που ακολουθείται τα τελευταία 100 χρόνια σε ελέγχους ρουτίνας του πόσιμου νερού είναι η ανίχνευση της ομάδας των κολίμορφων βακτηρίων και του βακτηρίου E. coli, τα οποία αποτελούν τους κύριους μικροβιακούς δείκτες. Η παρούσα μελέτη περιέλαβε τόσο τον έλεγχο των κλασσικών τεχνικών καλλιέργειας σε εκλεκτικά και διαγνωστικά θρεπτικά υποστρώματα, όσο και την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδων ανεξάρτητων της καλλιέργειας των μικροοργανισμών, όπως : α) PCR για την ανίχνευση του βακτηρίου E.coli, των ολικών κολίμορφων, του Enterococcus sp., του βακτηρίου Salmonella sp., β) Επιτόπιος Φθορίζων Υβριδισμός (FISH) για το γρήγορο προσδιορισμό διαφόρων μικροβιακών ομάδων και γ) σύγκριση των καθιερωμένων κλασσικών (ζύμωση σε δοκιμαστικούς σωλήνες, τεχνική ηθμομεμβράνης) και βιοχημικών μεθόδων (δραστηριότητα β-D-γαλακτοζιδάσης και β-D- γλουκουρονιδάσης) μεταξύ τους. Από τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας προέκυψε ότι ο ταμιευτήρας του Μαραθώνα έχει ένα σταθερό ως προς την ποικιλότητα μικροβιακό δυναμικό σε κάθε υπό εξέταση θέση - διαφορετικό σε υψηλό βαθμό μεταξύ αυτών των θέσεων τόσο ως προς την ποικιλότητα όσο και ως προς την αφθονία. Η κυριότερη βακτηριακή ομάδα που φάνηκε να επικρατεί, όπως προκύπτει από τα πειράματα κλωνοποίησης, ήταν αυτή των Actinobacteria. Ως προς τα Proteobacteria φαίνεται να υπάρχει μία ομοιόμορφη κατανομή των βακτηρίων της λίμνης στις ομάδες των α- και β-Proteobacteria και λιγότερο σε αυτή των γ- Proteobacteria, αντιπρόσωποι της οποίας ανακύπτουν συνηθέστερα όταν εφαρμόζονται οι κλασσικές μέθοδοι καλλιέργειας. Εξίσου σημαντική ομάδα φαίνεται να είναι και αυτή των Bacteroidetes, ενώ επίσης ανέκυψαν και αντιπρόσωποι των Acidobacteria, των Chloroflexi και της σχετικά πρόσφατα χαρακτηρισμένης ομάδας των Verrucomicrobia. Ένα εξίσου σημαντικό εύρημα ήταν η παρουσία κυανοβακτηριακών κλώνων χρονικά και τοπικά σταθερών, σε όλο το εύρος της λίμνης, μεταξύ των οποίων και κάποιοι δυνητικά τοξικοί κλώνοι του γένους Microcystis. Γενικότερα, το περιεχόμενο της λίμνης σε κυανοβακτήρια φαίνεται να έχει κύρια και άμεση σχέση με το χρόνο παραμονής του νερού στη φραγμαλίμνη (retention time). Ως προς την εφαρμογή της κλασσικής μεθοδολογίας καλλιεργειών σε δείγματα νερού για την εκτίμηση της μικροβιακής επιβάρυνσης του νερού στον ταμιευτήρα, αυτή παρουσίασε μειονεκτήματα, όπως είναι η έλλειψη εξειδίκευσης στην ανάκτηση συγκεκριμένων παθογόνων, ο περιορισμένος αριθμός εκλεκτικών υποστρωμάτων καλλιέργειας και τα σχετικά υψηλά όρια ανίχνευσης μικροοργανισμών. Σημαντικό ωστόσο εύρημα αποτελεί η επιβεβαίωση της υπόθεσης ότι οι εντερόκοκκοι φαίνεται να συσχετίζονται καλύτερα με συμβάντα γαστροεντερικών ασθενειών και πιθανόν να αποτελούν καλύτερους δείκτες της κοπρανώδους μόλυνσης στο νερό από ότι το βακτήριο E. coli και κυρίως από τα κολίμορφα βακτήρια. Ως εκ τούτου, οι εντερόκοκκοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν τουλάχιστον συμπληρωματικά στους ελέγχους ρουτίνας. Ωστόσο, αν και η κλασική μεθοδολογία παρουσιάζει κάποια μειονεκτήματα, οι μοριακές τεχνικές απαιτούν περαιτέρω βελτιστοποίηση. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή PCR απευθείας σε δείγματα νερού είναι δυνατό να οδηγήσει σε ψευδή θετικά αποτελέσματα, είτε λόγω πολύ χαμηλής συγκέντρωσης της υπό ανίχνευσης ομάδας είτε λόγω της διακριτικής ικανότητας της μεθόδου. Επιπρόσθετα, τα ψευδή αυτά αποτελέσματα συχνά αποδίδονται και στη μειωμένη εξειδίκευση των εκκινητικών μορίων που χρησιμοποιούνται και που αποσκοπούν στο να διακρίνουν μεταξύ πολύ στενά συγγενικών βακτηρίων (π.χ. κολίμορφα και E. coli). Τέλος, η τεχνική FISH μπορεί να δώσει αξιόπιστα και επιπρόσθετα της PCR και ποσοτικά αποτελέσματα. Ωστόσο, παρουσιάζει και αυτή προβλήματα που σχετίζονται με τα υψηλά όρια ανίχνευσής της, καθώς και με το χρόνο κατεργασίας των δειγμάτων, ο οποίος δεν είναι λιγότερος από εκείνον που απαιτείται για μία απλή αντίδραση PCR, ειδικά όταν και στην περίπτωση αυτή πρέπει να εφαρμοστούν καλλιέργειες εμπλουτισμού των συνήθως φτωχών σε συγκεκριμένα βακτήρια (π.χ. Salmonella sp.) δειγμάτων νερού.