Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για τον προσδιορισμό σουλφοναμιδίων σε τρόφιμα ζωϊκής προέλευσης

Abstract

Sulfonamides (SAs), N-derivatives of 4-amino-benzenesulfonamide, comprise a large group of synthetic antibacterial compounds. They have been widely used in animal feed as growth promoters to prevent and treat a series of diseases in animal feeding, such as infectious diseases of digestive and respiratory tracts. In the European Union (EU), sulfonamides are the second most widely used veterinary antibiotics. The extensive use of sulfonamides in animal husbandry and the insufficient withdrawal time for treated animals has been associated with the presence of sulfonamide residue in meat and meat products The amount of sulfonamides residues is of particular concern due to their potential carcinogenic character. They may also cause development of antibiotic resistance in humans and severe allergic reactions. The aim of this study was to develop simple direct and reliable methods for the simultaneous determination of ten sulfonamides residues, sulfadiazine (SDZ), sulfathiazine (STZ), sulfamethoxine (SMTH), sulfamethizole (SMZ), sulfamethoxypyridazine (SMPZ), sulfamonomethoxine (SMMX), sulfamethoxazole (SMXZ), sulfisoxazole (SIX), sulfadimethoxine (SDMX) and sulfaquinoxaline (SQX), in bovine, porcine and chicken tissue, whole egg and milk. The proposed methods were fully validated according to the criteria enacted by European commission decision 2002/657/EC. The separation of the examined sulfonamides and caffeine, which was used as an internal standard was achieved on a Kromasil, C18 5 μm, 250 × 4 mm analytical column operated at ambient temperature, with observed backpressure ranging from 190 to 220 kg/cm2. The mobile phase, a mixture of 0.1 % formic acid as solvent A, CH3CN as solvent B and CH3OH was delivered to the analytical column according to a gradient program. The flow rate during the analysis was stable at 1 mL/min. An equilibration time of 5 min was required between runs. The monitoring of the examined SAs was performed at 265 nm.

Overall recoveries of SAs from spiked samples at fortification levels of 50, 100 and 150 μg/kg were higher than 92.1% in bovine tissue, higher than 90.1% in porcine tissue, higher than 90.3% in chicken tissue, higher than 92.0% in egg samples and higher than 93.9% in milk samples. All limits of quantitation (LOQ) values achieved were much lower than the MRL value set by the E.U. The decision limits CCa calculated by spiking 20 samples, of each matrix at MRL values (100 μg/kg), ranged from 103.68 to 112.36 μg/kg for bovine tissue, from 108.13 to 110.13 μg/kg for porcine tissue and from 103.93 to 111.92 μg/kg for chicken tissue while detection capability CCb ranged from 111.62 to 121.26 μg/kg, from 111.74 to 124.83μg/kg and from 111.32 to 119.86 μg/kg respectively. For egg and milk samples, CCa ranged from 101.74 to 108.42 μg/kg and from 106.84 to 119.01 μg/kg, while detection capability CCb ranged from 106.84 to 119.01 μg/kg and from 105.64 to 119.01 μg/kg, respectively. All the methods proposed are simple and reliable validated assays, which can be readily adapted by any laboratory for the quality control and the quantitative determination of residues of the ten examined sulfonamides in tissues, whole egg and milk.

Τα σουλφοναμίδια είναι αντιβακτηριακά φάρμακα ευρέος-φάσματος τα οποία αναστέλλουν τη σύνθεση του βακτηριακού υποστρώματος, τόσο των θετικών κατά Gram βακτηρίων (+) όσο και των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (-). Χρησιμοποιούνται στην κτηνιατρική, στη γεωργία, στην ιχθυοκαλλιέργεια, σε ζωοτροφές ως αυξητικός παράγοντας αλλά και για την πρόληψη και τη θεραπεία μιας σειράς μολυσματικών ασθενειών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επετεύχθη η ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων για τον ταυτόχρονο διαχωρισμό και ποσοτικό προσδιορισμό δέκα σουλφοναμιδίων της σουλφαδιαζίνης (SDZ), της σουλφαθειαζόλης (STZ), της σουλφαμεθαζίνης (SMTH), της σουλφαμεθειζόλης (SMZ), της σουλφαμεθόξυπυριδαζίνης (SMPZ), της σουλφαμονομεθοξίνης (SMMX), της σουλφαμεθοξαζόλης (SMXZ), της σουλφισοξαζόλης (SIX), της σουλφαδιμεθοξίνης (SDMX) και της σουλφακινοξαλίνης (SQX) σε μία σειρά κτηνοτροφικών προϊόντων ευρείας κατανάλωσης (βόειοι και χοίρειοι μυϊκοί ιστοί, μυϊκοί ιστοί πουλερικών, αυγά και γάλα) με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης. Ο διαχωρισμός των δέκα εξεταζόμενων ενώσεων επετεύχθη με αναλυτική στήλη Kromasil, C18, 5 μm, 250 × 4 mm ενώ ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα μυρμηκικού οξέος 0.1%, ακετονιτριλίου και μεθανόλης με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Ο συνολικός χρόνος για την έκλουση των δέκα ενώσεων ήταν 36 min. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των εξεταζόμενων ενώσεων τόσο στα πρότυπα διαλύματα, όσο και στα διάφορα υποστρώματα έγινε με τη μέθοδο του εσωτερικού προτύπου και μετά από μια σειρά δοκιμών επιλέχθηκε η καφεΐνη σε συγκέντρωση 3 ng/μL. Η γραμμικότητα της μεθόδου στα πρότυπα διαλύματα κρίνεται πολύ ικανοποιητική με τους συντελεστές συσχέτισης των ευθειών των πρότυπων καμπυλών που χαράχθηκαν, να κυμαίνονται από 0,9928 έως 0,9999. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης που επιτεύχθηκαν κυμαίνονταν από 0,8 έως 6,7 ng/μL και από 2,5 έως 20,1 ng/μL αντίστοιχα. Για την εφαρμογή της μεθόδου στον προσδιορισμό των δέκα σουλφοναμιδίων στα υποστρώματα που επιλέχθηκαν αναπτύχθηκαν ξεχωριστά πρωτόκολλα προκατεργασίας για καθένα από αυτά. Το γενικό σχήμα της προκατεργασίας περιελάμβανε μια σειρά από κοινά βήματα, αλλά για υπόστρωμα απαιτήθηκε η χρήση διαφορετικού εκχυλιστικού συστήματος. Στους μυϊκούς ιστούς και το αυγό απαιτήθηκε περαιτέρω καθαρισμός του εκχυλίσματος με την τεχνική της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE), ενώ για το εκχύλισμα που προέκυψε μετά την κατεργασία του γάλακτος αυτό δεν ήταν απαραίτητο. Μετά την κατάλληλη κατεργασία κάθε υποστρώματος στα αντίστοιχα χρωματογραφήματα δεν υπήρχαν κορυφές που να εκλούονται στον ίδιο χρόνο με τις εξεταζόμενες ενώσεις. Όλες οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν για τον προσδιορισμό των δέκα ενώσεων στα διάφορα υποστρώματα επικυρώθηκαν σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά επίδοσης και τις απαιτήσεις που ορίζει η οδηγία 2002/657/ΕΕ ως προς τα κριτήρια της γραμμικότητας, της επαναληψιμότητας, της ενδιάμεσης επαναληπτικότητας, της ευαισθησίας, της εκλεκτικότητας, της σταθερότητας του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης. Τα όρια ποσοτικής αποτίμησης για όλα τα σουλφοναμίδια σε όλα τα υποστρώματα ήταν κατά πολύ χαμηλότερα από το μέγιστο επιτρεπόμενο όριο που έχει θέσει η Ευρωπαϊκή Ένωση. Εξετάστηκε η σταθερότητα των σουλφοναμιδίων σε εμβολιασμένα δείγματα κατά την αποθήκευσή τους σε θερμοκρασία δωματίου, στους 4οC και στους -18 οC. Επίσης ελέγχθηκε η σταθερότητα τους μέσα από κύκλους ψύξης-απόψυξης. Όλες οι ενώσεις ήταν σταθερές σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 8 h, στους 4οC για τουλάχιστον 4 ημέρες και στους -18 οC για τουλάχιστον 4 εβδομάδες και για τουλάχιστον τέσσερις κύκλους ψύξης-απόψυξης. Όλα τα χαρακτηριστικά των μεθοδολογιών που αναπτύχθηκαν καθιστούν την εφαρμογή τους δυνατή, αξιόπιστη και εύκολη στην ανίχνευση και στον ποσοτικό προσδιορισμό των δέκα σημαντικότερων σουλφοναμιδίων στα πιο διαδεδομένα κτηνοτροφικά προϊόντα.