Μοριακή αρχιτεκτονική των πρωτεϊνών του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ του βακτηρίου Pseudomonas syringae

Abstract

Type III secretion system (T3SS) is a conserved in structure and function macromolecular multiprotein complex, built from over 20 proteins encoded by conserved pathogenicity islands (PAIs) found in many Gram negative bacteria with known pathogenic, symbiotic or commensal associations with eykaryotic organisms. Νine of the T3SS proteins are similar to proteins of the flagellar basal body, which reflects the distant evolutionary relationship between these two systems. The present study concerns the characterization of the T3S protein interaction network in the phytopathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, using new molecular and biophysical methods. A bicistronic plasmid vector, pPROPET, was used for the heterologous co-expression of TTSS proteins in E.coli. For the HrpG protein, the genomic location next to the gene coding for the HrcC secretin suggested that it is a putative class I T3SS chaperone and the protein was isolated as a complex with the regulatory protein HrpJ, after co-expression in E. coli. The HrpG, HrpV and HrpJ proteins were also isolated as a ternary complex. The binding region of HrpV and HrpJ on HrpG appear to be overlapping. The HrpG-HrpJ interaction provides a missing link in the T3SS regulatory network which so far involved proteins HrpG, HrpV, HrpS & HrpR and HrpL, coded by the hrp/hrc PAI. Further, HrpG was shown to interact with the carboxy-terminal, cytoplasmic domain of the transmembrane core protein HrcU and, less strongly, with the cytoplasmic protein HrpO. The interactions with predicted components of the P.syringae T3SS Cring further support a T3SS chaperone role for protein HrpG. Moreover, a complex between the T3SS ATPase, HrcN, and its negative regulator HrpE was isolated at pH 11 but not at pH 8 from E. coli overexpressing the two proteins. Gel filtration experiments revealed two distinct forms of the complex, each with different apparent molecular size and different subunit stoichiometry in gel filtration experiments. The physicochemical properties of selected T3SS soluble proteins were studied at pH 8 & 11 by gel filtration, small-angle X-ray scattering and circular dichroism methods. These studies included the following proteins: a) harpin (HrpZ), b) HrpP (putative substrate specificity switch protein, by analogy to the Yersinia YscP and the flagellum FliK proteins), c) HrpE (negative regulator of HrcN ATPase) and its carboxy-terminal domain and d) the HrpG-HrpV complex, isolated after coexpression from the bicistronic vector pPROPET. Extreme alkaline pH conditions: a) resulted in the solubilization of large aggregates of the co-expressed proteins, b) promoted a more extended form for secreted proteins HrpZ, HrpP without disturbing the homodimer formation, c) disrupted the putative HrpE homotetramer, favoring its dimeric form, d) did not disrupt the HrcN-HrpE complex, e) lead to a reduction of the α-helix content in favor of β-strand in all cases, although it did not result in a collapse of the secondary structure, f) had a little or no effect on the tertiary structure of the proteins investigated, as judged by circular dichroism studies in near UV, g) reduced the thermal stability for almost all proteins examined, as judged by the reduction in the TM value during thermal denaturation and h) did not lead to formation of intermediates during the thermal transition from the folded to the unfolded state for any of the proteins investigated.

Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Τ3SS, type three secretion system) είναι ένα δομικά και λειτουργικά συντηρημένο υπερμοριακό σύμπλοκο δομούμενο από περισσότερες από 20 διαφορετικές πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από συντηρημένες γονιδιακές «νησίδες» οι οποίες απαντώνται σε πολλά αρνητικά κατά Gram βακτήρια, κατά κανόνα είτε συμβιωτικά είτε παθογόνα ευκαρυωτικών οργανισμών. Εννέα από τις πρωτεΐνες του Τ3SS έχουν σημαντικό βαθμό ομολογίας, σε επίπεδο πρωτοταγούς αλληλουχίας, με πρωτεΐνες που δομούν στοιχεία του βασικού σωματίου του βακτηριακού μαστιγίου, με το οποίο το Τ3SS έχει κοινές εξελικτικές ρίζες. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών που δομούν το T3SS του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, αξιοποιώντας κυρίως ένα δικιστρονικό πλασμιδιακό φορέα, τον pPROPET ο οποίος κατασκευάστηκε στην πορεία της διατριβής, για την ετερόλογη συνέκφραση πρωτεϊνών στην Escherichia coli και συγκαθαρισμό συμπλόκων μεταξύ επιλεγμένων ζευγών πρωτεϊνών. Για την πρωτεΐνη HrpG, η θέση του κωδικού της πλαισίου σε σχέση με της σεκρετίνης HrcC υπέδειξε ρόλο πιθανήs σαπερόνηs τάξης Ι. Περεταίρω ένδειξη ενός τέτοιου ρόλου προέκυψε από την κατάδειξη αλληλεπίδρασης της με τη ρυθμιστική του συστήματος πρωτεΐνη HrpJ μετά από συνέκφραση και συγκαθαρισμό σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα. Οι πρωτεΐνες HrpG-HrpV-HrpJ ανιχνεύτηκαν ως σύμπλοκο μετά από συνέκφραση από τρικιστρονική κασέτα στην E. coli. Οι θέσεις πρόσδεσης των HrpV και HrpJ επί της HrpG πιθανόν να είναι αλληλεπικαλυπτόμενες. Η αλληλεπίδραση HrpG-HrpJ συμπληρώνει τον ελλειπή κρίκο της αλυσίδας πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που εμπλέκονται στη μεταγραφική ρύθμιση του TTSS, στην οποία, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, συμμετέχουν οι πρωτεΐνες HrpG, HrpV, HrpS, HrpR και ΗrpL που κωδικοποιούνται από τη νησίδα hrp/hrc. Πειράματα συνέκφρασης/συγκαθαρισμού έδειξαν ομοίως ότι η πρωτεΐνη HrpG αλληλεπιδρά ισχυρά με την καρβοξυτελική κυτταροπλασματική επικράτεια της μεμβρανικής πρωτεΐνης HrcU, συστατικού του κεντρικού πυρήνα του ενυοσώματος, και λιγότερο ισχυρά με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη HrpO. Οι αλληλεπιδράσεις της HrpG με μέλη του C-δακτυλίου υποστηρίζουν τον ρόλο σαπερόνης του T3SS για την πρωτεΐνη. Συμπληρωματικά, απομονώθηκε μετά από ετερόλογη έκφραση το σύμπλοκο HrcN-HrpE, ATPάσης του Τ3SS και αρνητικού ρυθμιστή της αντίστοιχα, αλλά μόνο σε ακραία αλκαλικό pH. Πειράματα μοριακής διήθησης κατέδειξαν την ύπαρξη δυο διαφορετικών μορφών του συμπλόκου HrcNHrpE με διαφορετική μοριακή μάζα και πιθανή στοιχειομετρία. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες μιας σειράς επιλεγμένων διαλυτών πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων του T3SS της P. syringae pv. phaseolicola μελετήθηκαν σε τιμές pΗ 8 και 11 με μεθόδους μοριακής διήθησης, σκέδασης ακτίνων Χ σε μικρές γωνίες (SAXS) και κυκλικού διχρωισμού (CD): Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν ήταν: α) η χαρπίνη HrpZ, β) η πρωτεΐνη HrpP, φερόμενη ως διακόπτης αλλαγής ειδίκευσης έκκρισης υποστρώματος κατ’ αναλογία με τις ανάλογές της πρωτεΐνες YscP στη Yersinia και FliK του μαστιγιακού TTSS, γ) η πρωτεΐνη HrpE (αρνητικός ρυθμιστής της ATPάσης του συστήματος HrcN) και η καρβοξυτελική της επικράτεια, ξεχωριστά και δ) το σύμπλοκο HrpG-HrpV, απομονωμένο μετά από υπερέκφραση από τον αντίστοιχο δικιστρονικό φορέα. Το ακραίο αλκαλικό pΗ: α) προώθησε την αποσυσσωμάτωση των μεγαλομοριακών φυσικών πληθυσμών των πρωτεϊνών, όπως εκτιμήθηκε από την υποχώρηση του εντοπιζόμενου στο νεκρό όγκο των στηλών μοριακής διήθησης ποσοστού της κάθε πρωτεΐνης, β) οδήγησε στην εκτεταμένη διαμόρφωση των εκκρινόμενων πρωτεϊνών HrpZ, HrpP αφήνοντας άθικτα τα διμερή τους, γ) διέσπασε το πιθανό τετραμερές της πρωτεΐνης HrpE στην κατάσταση πιθανώς του διμερούς, δ) δεν διέσπασε το σύμπλοκο HrcN-HrpE, ε) οδήγησε σε μείωση των ποσοστών α-έλικας προς όφελος των ποσοστών β-κλώνων σε όλες τις περιπτώσεις αλλά σε καμία περίπτωση δεν επέφερε κατάρρευση της πρωτεϊνικής δευτεροταγούς δομής, στ) είχε μικρή ή καμία επίδραση στην τριτοταγή διαμόρφωση των υπό εξέταση μορίων, όπως έδειξαν μελέτες κυκλικού διχρωισμού στο εγγύς υπεριώδες ζ) κατά κανόνα οδήγησε σε μείωση της θερμοσταθερότητας των εξετασθέντων πρωτεϊνών, όπως αυτή εκφράζεται από την μείωση του σημείου μετάπτωσης (ΤΜ), και η) σε καμία περίπτωση δεν οδήγησε σε εμφάνιση ενδιάμεσων καταστάσεων κατά τη μετάβαση των μορίων από την αναδιπλωμένη στην αποδιπλωμένη μορφή.