Δομικά χαρακτηριστικά υποψηφίων σαπερονών του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ και των συμπλόκων τους

Abstract

Type III secretion systems (T3SSs) are essential mediators of the interaction of many Gram-negative bacteria with plant or animal eukaryotic cells. The T3SS pathway of plant pathogens is encoded by hrp (HR and pathogenicity) and hrc (HR and conserved) genes. The Hrc proteins direct secretion of T3SS substrates across the bacterial envelope, whereas a subset of the Hrp proteins, whose function is only partially defined, are themselves secreted by the T3SS and direct the translocation of effectors through host cell barriers. HrpG is a hypothetical class I T3SS chaperone as predicted by fold recognition algorithms and Pseudomonas syringae T3SS genes organization. Small angle X-ray scattering and circular dichroism experiments were used for evaluation of this hypothesis. In contradistinction to the homodimeric class I T3SS chaperones, HrpG forms a tetramer in solution. However the protein particle does not possess the symmetry of a closed tetrameric complex. Deletion of the 14 carboxyterminal residues led to the formation of a stable dimer in solution with the appropriate symmetry. Although the dimeric particle possesses the overall shape of class I T3SS chaperones, we could not conclusively propose that HrpG belongs to this class of chaperones because of its longer diameter and the higher content of α-helix. Moreover, HrpG was found to interact with HrpO and the carboxyterminal domain of HrcU through native electrophoresis. HrpO is a highly soluble protein of the T3SS of P. syringae pv phaseolicola. Size exclusion chromatography profiles resemble those obtained by FliJ (Fraser et al. 2003). Thus, an aberrant elution profile was also demonstrated for HrpO in the present work. HrpO was found to have an extended shape in solution by SAXS with low melting temperature by CD experiments. During the thermal unfolding experiments no intermediate population of the protein is observed. The high content of secondary structure however, discourages the classification of HrpO with intrinsically unfolded proteins (IUp). Class I T3SS chaperones bind to the N-terminal part of effectors and deliver them to the T3SS ATPase for translocation. The avrPphF operon of P. syringae pv phaseolicola possesses two open reading frames, a class I T3SS chaperone (ORF1) and its cognate virulence effector (ORF2). Although each of the proteins crystallizes quite easily, the complex was recalcitrant to crystallization. Here we present the preliminary crystallographic analysis of the AvrPphF ORF1 crystals as well as the solution structure of the AvrPphF ORF1/ORF2 complex based on small angle X-ray scattering data.

Τα εκκριτικά συστήματα τύπου ΙΙΙ (T3SSs) αποτελούν εξειδικευμένα όργανα αλληλεπίδρασης πολλών Gram-αρνητικών βακτηρίων με τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το μονοπάτι έκκρισης κωδικοποιείται από τα γονίδια hrp (HR και pathogenicity) και hrc (HR και conserved). Οι πρωτεΐνες Hrc κατευθύνουν την έκκριση των υποστρωμάτων διαμέσου του βακτηριακού φακέλου, ενώ ένα υποσύνολο των πρωτεϊνών Hrp, με μερικώς προς το παρόν μόνο προσδιορισμένες λειτουργίες, εκκρίνονται από το σύστημα και/ή βοηθούν στην έκκριση των υποστρωμάτων. Η πρωτεΐνη HrpG είναι μία υποθετική τάξης Ι σαπερόνη του Τ3SS, όπως προβλέπεται από αλγορίθμους αναγνώρισης αναδίπλωσης και από τoν τρόπο οργάνωσης της νησίδας παθογένειας της Pseudomonas syringae. Πειράματα σκέδασης ακτίνων-Χ (SAXS) σε μικρές γωνίες και κυκλικού διχρωισμού χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της υπόθεσης αυτής. Σε αντιδιαστολή με την τάξη των ομοδιμερών τάξης Ι σαπερονών, η HrpG σχηματίζει τετραμερές σε διάλυμα. Παρόλα αυτά το τετραμερές πρωτεϊνικό σωματίδιο δεν φαίνεται να διαθέτει την αντίστοιχη συμμετρία ενός κλειστού συμπλόκου. Η απαλοιφή των 14 καρβοξυτελικών αμινοξέων της πρωτεΐνης οδηγούν στον σχηματισμό σταθερού διμερούς στο διάλυμα με την απαραίτητη δομική συμμετρία. Το διμερές σωματίδιο προσεγγίζει το γενικό σχήμα των τάξης Ι σαπερονών αλλά η κατάταξη της πρωτεΐνης στην οικογένεια των τάξης Ι σαπερονών είναι αμφίβολη λόγω της μεγαλύτερης διαμέτρου του σωματιδίου και των υψηλών ποσοστών α-ελίκων που φαίνεται να διαθέτει. Επιπρόσθετα παρατηρήθηκε μέσω εγγενούς ηλεκτροφόρησης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης HrpG με την καρβοξυτελική επικράτεια της HrcU και την πρωτεΐνη HrpO. H πρωτεΐνη HrpO είναι μία διαλυτή πρωτεΐνη του Τ3SS της P. syringae pv phaseolicola. Το χρωματογραφικό πρότυπο της στην στήλη μοριακής διήθησης προσεγγίζει το αντίστοιχο της μαστιγιακής πρωτεΐνης FliJ. Η πρωτεΐνη βρέθηκε να έχει μία εκτεταμένη δομή στο διάλυμα μέσω πειραμάτων SAXS, ενώ συγχρόνως παρουσιάζει χαμηλή θερμοκρασία μετάπτωσης, όπως αυτή καταγράφηκε μέσω κυκλικού διχρωισμού. Κατά την μετάπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκε συσσώρευση ενδιάμεσου πληθυσμού. Τα υψηλά ποσοστά δευτεροταγούς δομής όμως αποκλείουν την ταξινόμηση της πρωτεΐνης στην οικογένεια των εγγενώς αδίπλωτων πρωτεϊνών. Οι τάξης Ι σαπερόνες του T3SS δεσμεύουν το αμινοτελικό τμήμα των δραστικών πρωτεϊνών και παραδίδουν τις πρωτεΐνες αυτές στην ΑΤΡάση του συστήματος. Το οπερόνιο avrPphF της P. syringae pv phaseolicola διαθέτει δύο ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης, μία τάξης Ι σαπερόνη (ORF1) και την συγγενική σε αυτήν δραστική πρωτεΐνη (ORF2). Παρόλο που και οι δύο πρωτεΐνες κρυσταλλώνουν αρκετά εύκολα, το σύμπλοκο τους δεν ήταν δυνατό να κρυσταλλώσει. Εδώ παρουσιάζεται η προκαταρκτική ανάλυση των κρυστάλλων της πρωτεΐνης AvrPphF ORF1 και η δομή του συμπλόκου AvrPphF ORF1/ORF2 στο διάλυμα βασισμένη σε πειράματα σκέδασης ακτίνων-Χ σε μικρές γωνίες.