Μελέτη του ρόλου των πρωτεογλυκανών θειικής ηπαράνης σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μελανώματος μεταστατικής και πρωτοπαθούς προέλευσης: έλεγχος και συγκριτική ανάλυση της βιοσύνθεσης, της βιοδιαθεσιμότητας και της συνεισφοράς αυτών των πρωτεογλυκανών στον καρκινικό φαινότυπο

Abstract

Melanoma is an aggressive cancer, deriving from malignant transformation ofmelanocytes. Melanocytes are attached on to the basal membrane-containingkeratinocytes and produce melanin. Extracellular matrix and melanoma cellinteractions are important regulators of melanoma progression and their study becomes essential because of the increased frequency and poor prognosis at the early stages of melanoma stages.Proteoglycans (PGs) are complex macromolecules consisting of glycosaminoglycans (GAGs) - covalently attached on to the protein core. They are divided into different isoforms according to their location, in extracellular, cell membrane and intracellular PGs. Heparan sulplhate proteoglycans (HSPGs) act as coreceptors on the cell surface. These receptors may affect many cellular events, including cell proliferation, cell adhesion and differentiation, by inducing intracellularsignals. Melanoma cells interact with their surrounding environment through cell -cellcontact, producing numerous molecules. Autocrine growth factors such as FGF-2produced by melanoma cells stimulate cell proliferation, whereas paracrine growthfactors such as PDGF and VEGF, regulate tumour cell growth and cell invasion byinducing changes in the environment. Growth factors expressed by melanoma cellsincluding PDGF, FGF-2, VEGF, and TGFb, stimulate radial (RGP) or vertical growthphase (VGP) formation, indicating a key role in cancer progression. FGF-2, TGF band PDGF are overexpressed either in VGP or in metastatic melanoma cells. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2), the most abundant growth factor producedby melanoma cells but not by normal melanocytes, is an important regulator of cellproliferation, migration and differentiation. In this study we show that M5 humanmetastatic melanoma cells’ ability to migrate is significantly enhanced byexogenously added FGF-2 while, neutralization of endogenous FGF-2 stimulates their adhesion. Previously, we have demonstrated that FGF-2 distinctly modulates the synthesis of individual (GAGs/PGs) subclasses, changing both their amounts anddistribution in M5 cells. Here, treatment with FGF-2 strongly reduces the expression levels of the heparan sulphate containing proteoglycan, syndecan-4. Syndecan-4 is a focal adhesion component in a range of cell types, adherent to several different matrix molecules, including fibronectin (FN). The reduction in syndecan- 4 expression byutilizing specific siRNA discriminately increased melanoma cell motility and decreased their attachment on FN, demonstrating a regulatory role of syndecan-4 onthese cell functions. Syndecan-4 has previously been demonstrated to regulate focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation. In this study FGF-2 was shown to downregulate FAK Y397-phosphorylation during FN-mediated M5 cell adhesion, promoting their migration. The observed decrease in FAK Y397 activation was correlated to syndecan-4 expression levels. Thus, a balance in syndecan-4 expression perpetrated by FGF-2 may be required for optimal M5 cell migration. Heparin and its various derivatives affect cancer progression in humans. In this study, we show that heparin uptaken intracellularly by melanoma cells activated a signaling cascade, which in turn inhibited melanoma cell adhesion and migration. The reduced ability of M5 cells to adhere onto the FN substrate was directly correlated to a decrease in the expression of focal adhesion kinase (FAK), which is a key regulator of melanoma motility. Cell treatment with heparin caused a marked downregulation inFAK expression (P <0.01). This is followed by an analogous inhibition of bothconstitutive and FN-induced FAK Y397-phosphorylation (P< 0.01). Moreover, heparin stimulated the P53 expression (P <0.001) of M5 cells and its increased accumulation in the nucleus. This favours a decrease in FAK promoter activation and explains the reduced FAK transcript and protein levels. In conclusion, the results ofthis study clearly demonstrate that the action of heparin in the regulation of melanoma cell adhesion and migration involves a P53/FAK/signaling pathway. Low molecular weight heparin (LMWH) has significant antimetastatic capabilities and affects cancer progression in humans. However, the mechanism by which LMWH affects cancer cell behavior is not known. Here we evaluated its activity at the intracellular level and how it is correlated with melanoma cell adhesionand migration. Treatment of M5 melanoma cells with LMWH caused a marked downregulation of constitutive phosphorylation as well as the FN-induced phosphorylation(p≤0,01) in protein kinase alpha (PKCa), as demonstrated by confocal microscopyand western blotting, LMWH treatment altered the distribution of pPKCa between the cytoplasm and nuclear region with a profound decrease in the cytoplasmic pPKCa (p≤0,05) and a simultaneous enhancement of nuclear pPKCa localization (p≤ 0,01). A significant decrease in the levels of pJNK (p≤0,01), which is a downstream effector ofPKCa, was also demonstrated in the LMWH-treated cells. The lineage activation ofPKCa-JNK / p38 and their correlation to M5 cell adhesion was confirmed with the utilization of specific inhibitors. The reduced ability of the LMWH-treated M5 melanoma cells to adhere onto the fibronectin (FN) substrate (p≤0,01) was directly correlated to a decrease in the activation of PKCa which is an important regulator of cell motility. LMWH-treated cells had disorganized actin stress fibers with a diffuse distribution of non-polymerized actin correlated to a strong decrease in cell –substratum interface area (p≤0,05) and altered morphology. It is postulated that LMWH through the downregulation of pPKCa and redistribution to nuclear regionattenuates JNK activation, which in turn induces cytoskeleton changes correlated toM5 cell decreased adhesion / migration. Conclusively, we show that the action of LMWH in the regulation of melanoma cell adhesion and migration involves a PKCa/JNK/ actin signalling pathway, which may be of paramount importance in the pharmacological targeting of melanoma. In conclusion we described important information regarding the mechanismsinvolved in the regulation of HSPGs and their biological behavior in human melanoma cells. Melanoma is one of the most aggressive skin cancers, and there is no prognosis available in the early stages of cancer. Thus continuous studies of the mechanisms involved in the development of melanoma, may offer candidate molecules and markers to aid melanoma prognosis and treatment.

Το μελάνωμα είναι ένας διαρκώς αυξανόμενος και ιδιαίτερα επιθετικός όγκος που προέρχεται από την κακοήθη εξαλλαγή των μελανοκυττάρων. Τα μελανοκύτταρα παράγουν μελανίνη και προσφύονται στη βασική μεμβράνη ανάμεσα στα κύτταρα της βασικής στoιβάδας των κερατινοκυττάρων. Κατά την εξέλιξη τους, ενδέχεται να παρουσιάσουν ένα μη φυσιολογικό μετασχηματισμό, γεγονός που οδηγεί στην δημιουργία και στην ανάπτυξη όγκου. Η ανάπτυξη του μελανώματος φαίνεται να επηρεάζεται από τις αλληλεπιδράσεις που υπάρχουν μεταξύ των νεοπλασματικών και των παρακείμενων φυσιολογικών κυττάρων του δέρματος, όπως είναι τα κύτταρα της δερμίδας. Επίσης, η ποιότητα και η ακεραιότητα της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη και την ανάπτυξη του μελανώματος. Η εμφάνιση και η βιολογική συμπεριφορά του μελανώματος τα τελευταία χρόνια έχει προκαλέσει ενδιαφέρον τόσο λόγω της αυξημένης συχνότητας και της φτωχής πρόγνωσης του. Οι πρωτεογλυκάνες (PGs) είναι σύμπλοκα μακρομόρια που αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό κορμό πάνω στον οποίο συνδέονται ομοιοπολικά μία ή περισσότερες αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών. Ανήκουν σε διαφορετικές τάξεις, ανάλογα με τον εντοπισμό τους ως προς το κύτταρο (εξωκυττάριες, μεμβρανικές και ενδοκυττάριες), ανάλογα με το είδος των γλυκοζαμινογκυκανών (GAGs) που περιέχουν, καθώς και ανάλογα με την πρωτογενή δομή του πρωτεϊνικού τους κορμού. Οι PGs, έχουν εξαιρετική ποικιλότητα ως προς το μέγεθος, το σχήμα και τη χημεία τους. Εκτός από το ότι παρέχουν ενυδατωμένο χώρο γύρω από τα κύτταρα, οι πρωτεογλυκάνες επιτελούν πολλές περίτεχνες λειτουργίες. Μπορούν να σχηματίσουν πηκτές με ποικίλη πυκνότητα φορτίων και μέγεθος πόρων, που δρουν ως ηθμοί για να ρυθμίζουν τη δίοδο μορίων διαμέσου του εξωκυττάριου χώρου. Σε συνδυασμό με τις κολλαγόνες ίνες προσδίδουν ισχύ και ανθεκτικότητα σε διάφορες δομές (μύτη, αυτιά,κ.ά.). Τα μέλη των πρωτεογλυκανών της οικογένειας κυρίως της θειικής ηπαράνης, λειτουργούν στην κυτταρική επιφάνεια ως υποδοχείς. Οι υποδοχείς αυτοί μεταβιβάζουν πληροφορίες στο εσωτερικό των κυττάρων που επιφέρουν αλλαγές στη μορφή, κινητικότητα, προσκόλληση, αύξηση και διαφοροποίησή τους. Τα κύτταρα του μελανώματος αντιδρούν με το μικροπεριβάλλον τους μέσω της απελευθέρωσης εκκρινόμενων ουσιών και μέσω της άμεσης κύτταρο με κύτταρο επαφής. Αυτοκρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο FGF-2 που παράγεται από τα κύτταρα του μελανώματος, διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των αρχέγονων κυττάρων και παρακρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο PDGF και ο VEGF ρυθμίζουν το μικροπεριβάλλον προάγοντας την ανάπτυξη του όγκου και την διήθηση του. Οι παρακρινικές επιδράσεις περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, την ίνωση και την αγγειογέννεση. Έχει αναφερθεί ότι η παραγωγή αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του μελανώματος είναι η κινητήριος δύναμη για την εξέλιξη του ακτινωτού (RGP) σε κατακόρυφο (VGP) μελάνωμα, διότι ελέγχουν εκτός από την ανάπτυξη του όγκου και τον σχηματισμό του στρώματος. Οι τέσσερεις, από το μελάνωμα παραγόμενοι, αυξητικοί παράγοντες με δυνατότητα επαγωγής του στρώματος είναι ο FGF-2, ο PDGF, ο VEGF και ο TGFb. Οι FGF-2, TGFb και οPDGF εκφράζονται από το πρωτοπαθές κατακόρυφα αναπτυσσόμενο μελάνωμα και από τα μεταστατικά κύτταρα του μελανώματος. Ένας από τους πιο σημαντικούς αυξητικούς παράγοντες που όπως ειπώθηκε προηγουμένως, προέρχονται από τα κύτταρα του μελανώματος αλλά όχι από τα φυσιολογικά μελλανοκύτταρα είναι ο FGF-2, ο οποίος θεωρείται ότι είναι σημαντικός ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης. Στη μελέτη μας δείχνουμε ότι η κυτταρική μετανάστευση στα ανθρώπινα Μ5 μεταστατικής ικανότητας κύτταρα μελανώματος αυξάνεται από τον εξωγενώς προστιθέμενο FGF-2, ενώ η ουδετεροποίηση του ενδογενή FGF-2 με τη χρήση ειδικού προς τον FGF-2 αντισώματος διεγείρει την κυτταρική προσκόλληση. Επίσης σε παλαιότερες μελέτες μας δείξαμε ότι ο FGF-2 επηρεάζει την κατανομή και την ποσότητα έκφρασης των γλυκοσαμινογλυκανών/πρωτεογλυκανών στα Μ5κύτταρα. Στη μελέτη μας φαίνεται ότι ο FGF-2 μειώνει την έκφραση της πρωτεογλυκάνης θειικής ηπαράνης-συνδεκάνη 4. Η συνδεκάνη 4 σε πολλές κυτταρικές σειρές, είναι ένα κύριο συστατικό για την εστιακή προσκόλληση αφού έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με πολλά μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως την ινονεκτίνη (FN). Χρησιμοποιήσαμε ειδικές αλληλουχίες siRNA προκειμένου να μπλοκάρουμε τη σύνθεση της ενδογενής συνδεκάνης 4. Η μείωση της συνδεκάνης 4 αύξησε την κινητικότητα των κυττάρων μελανώματος και συγχρόνως μείωσε την κυτταρική προσκόλληση στο ειδικό υπόστρωμα FΝ, γεγονός που μας δείχνει το σημαντικό ρόλο της συνδεκάνης 4 στη ρύθμιση των συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η συνδεκάνη 4 ρυθμίζει την φωσφορυλίωση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (focal adhesion kinase-FAK). Στις γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής ηπαράνης ανήκει και η ηπαρίνη η οποία αλληλεπιδρά με τους αυξητικούς παράγοντες και μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Μελέτες δείχνουν οτι η ηπαρίνη και τα παράγωγα της επηρεάζουν την εξέλιξη του καρκίνου. Στη μελέτη μας δείχνουμε ότι η ηπαρίνη με μοριακό βάρος 15-30kDa (unfractioned heparin-UFH) απορροφάται από τα κύτταρα και αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση επηρεάζοντας συγκεκριμένα σηματοδοτικά μονοπάτια. Η μειωμένη ικανότητα των κυττάρων να προσκολληθούν στο υπόστρωμα FN φαίνεται ότι συνδέεται με την μειωμένη έκφραση της FAK. Η εξωγενώς προστιθέμενη ηπαρίνη ανέστειλε σημαντικά την έκφραση τόσο της FAK όσο και τη φωσφορυλίωση της FAK που επάγεται από τη προσκόλληση στη FN. Επίσης, η ηπαρίνη φαίνεται να αυξάνει την έκφραση του P53 (p≤0.001) και συνεπώς τη συσσώρευσή του στον πυρήνα, γεγονός που αναστέλλει την διέγερση του ενεργοποιητή της FAK και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης της FAK. Από τα αποτελέσματα αυτά είναι ξεκάθαρο οτι η δράση της ηπαρίνης στη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης συνδέεται με τα P53/FAK σηματοδοτικά μονοπάτια που πιθανόν θα μπορούσαν να αποτελέσουν στόχο για τη θεραπεία του μελανώματος. Παρά την αντιμεταστατική δράσης της, η UFH δεν απορροφάται εύκολα από το έντερο και έχει δειχθεί ότι η μακροχρόνια χρήση της επιφέρει παρενέργειες στον οργανισμό. Θεωρήσαμε λοιπόν σημαντικό να εξετάσουμε την ηπαρινη μικρού μοριακού βάρους 5kDa (low molecular weight heparin-LMWH) και να διερευνήσουμε τις πιθανές κυτταρικές λειτουργίες της. Η LMWH παίζει προστατευτικό ρόλο στον καρκίνο. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου LMWH επηρεάζει την κυτταρική συμπεριφορά δεν είναι γνωστή. Μελετήσαμε τη δράση της σε ενδοκυτταρικό επίπεδο, και τον τρόπο που συμμετέχει στην κυτταρική προσκόλληση και τη μετανάστευση. Η χορήγηση της LMWH στα M5 κύτταρα προκάλεσε μείωση της ενεργοποίησης (p ≤ 0,01) της πρωτεϊνικής κινάσης (PKCa) ενώ επηρέασε και την κατανομή της pPKCa στο κύτταρο, προκαλώντας μείωση της pPKCa (p ≤ 0,05) στο κυτταρόπλασμα και ταυτόχρονα αύξηση στον πυρήνα (p ≤0,01). Η μείωση της προσκόλλησης και μετανάστευσης που παρατηρήθηκε από τη χορήγηση της LMWH, συνδέεται άμεσα με τη μείωση της ενεργοποίησης της PKCa. Επίσης η LMWH επηρέασε τη μορφολογία των κυττάρων και την οργάνωση των ινιδίων της ακτίνης, που όπως φάνηκε συνδέεται με τη μείωση ενός μορίου που ανήκει στην οικογένεια των ΜΑΡΚs, της pJNK (p ≤ 0,01).Από τα παραπάνω φαίνεται ο προστατευτικός ρόλος των HSPGs/HSGAGsστο μελάνωμα. Λάβαμε σημαντικές πληροφορίες όσον αφορά τη ρύθμιση της δράσης τους στη βιολογική συμπεριφορά κυττάρων ανθρώπινου μελανώματος και τους εμπλεκόμενους μηχανισμούς δράσης τους. Το μελάνωμα αποτελεί έναν από τους πιο επιθετικούς καρκίνους του δέρματος και η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου είναι μεγάλης σημασίας. Η δε μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του μελάνωματος αποσκοπεί στην άντληση βασικών πληροφοριών ικανών να οδηγήσουν στην αποτελεσματική αντιμετώπιση του μελανώματος.