Μελέτη του ρόλου των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων στην παθογένεια των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων

Abstract

Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise of a heterogeneous group of diseases which evolve from a clonal stem-cell haematopoietic disorder and are accompanied by immune disorders. Several lines of evidence suggest that immune deregulation in these disorders evokes autoimmune manifestations in the bone marrow, such as clonal T-cell expansions and elevated proinflammatory cytokine levels. The effect of immune deregulation is more profound in the early stages. Autoimmune manifestations lead to bone marrow failure, peripheral cytopenias and, finally, to systemic autoimmunity in up to 30% of the cases. Contrary to the early stages, progression of MDS is characterized by the immune evasion and selective growth advantage of the malignant clone. CD4+CD25+FOXP3+ T regulatory (Tregs) cells maintain immunological tolerance by actively suppressing immune responses. Increased Treg activity may protect from autoimmunity, but impairs immune surveillance and anti-tumour immune responses. On the other hand, reduced Treg activity is associated with development of autoimmunity and more effective immune surveillance. The co-existence of malignancy with autoimmunity and immune-mediated bone marrow failure in MDS led us to the hypothesis that these two distinct processes might be subject to aberrant immune regulation by Tregs. Considering the major role that Tregs play in regulating immune responses as well as the involvement of the immune system in MDS pathogenesis, the purpose of this study was to thoroughly investigate Treg dynamics and function in MDS patients of both early and late stages of the disease. Initially, Treg number, frequency and function were studied in both peripheral blood and bone marrow. Subsequently, differences in chemokine receptor profile of Tregs were addressed along with their migration potential. Finally, Treg number was monitored during disease progression and response to chemotherapy. PATIENTS AND METHODS: Treg number and frequency as well as CXCR4 expression were assessed by flow cytometry in peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) of early-stage (E-MDS, n=44) and late-stage MDS patients (L-MDS, n=19). The control group was comprised of 28 haematologically normal age-matched individuals (Normal), 14 of whom had undergone orthopaedic surgery. Treg function was evaluated by proliferation/suppression assays performed with magnetically isolated CD4+CD25- and CD4+CD25high cells after polyclonal stimulation with soluble CD3/CD28 beads. IFN-γ and TNF-α levels were determined in the supernatants of the proliferation/suppression assays by flow cytometry, using CBA (Cytometric Bead Array) method, while CXCL12 and TNF-α were detected by ELISA in bone marrow fluid and serum. The significance of the differences was assessed by one-way ANOVA or paired Student’s t test as appropriate. RESULTS: CD4+CD25+FOXP3+ Treg number and frequency in PB as well as Treg frequency in BM of L-MDS patients displayed a more than two-fold increase compared to both normal individuals and E-MDS patients. No difference was detected between controls and E-MDS patients. A significant Treg expansion was observed during disease progression, where Treg number in PB followed tumour burden fluctuations prior to and after response to chemotherapy. Finally, both in PB and BM, the naive CD45RA+ Tregs were predominantly expanded in L-MDS. As far as Treg function is concerned, Tregs of E-MDS patients exerted a defective suppressive capacity both in PB and BM. In particular, in E-MDS patients, Tregs were less effective in suppressing autologous polyclonal T-cell proliferative responses compared to normal individuals and L-MDS patients. Furthermore, measurement of IFN-γ and TNF-α concentrations yielded comparable results with the in vitro proliferation of T effector cells. Tregs from E-MDS patients failed to suppress IFN-γ and TNF-α production from autologous CD4+CD25- cells both in PB and BM compared to normal controls and L-MDS patients. Regarding the Treg migratory properties, CXCR4 expression was reduced in PB Tregs of E-MDS patients compared to normal individuals and L-MDS patients. In accordance to this finding, PB Tregs from E-MDS patients exhibited decreased in vitro chemotaxis compared to normals and L-MDS patients. On the contrary, Tregs from normal and L-MDS patients displayed comparable CXCR4 expression and chemotaxis. Moreover, in vitro chemotaxis was similar to all three study groups when normal PB Tregs migrated towards bone marrow fluid of patients and normal controls. Finally, BM Treg frequency levels in E-MDS patients were significantly decreased compared to PB, while normal controls and L-MDS patients exerted no difference between these two compartments. CONCLUSIONS: In conclusion, this study indicates the involvement of Tregs in the pathophysiology of MDS. The numerical and functional defects of Tregs at the early stages of the disease, where autoimmune manifestations are prominent, as well as the Treg expansion followed by recovery of their function in the late stages, where tumour escape is dominant, imply a link between Treg impairment and MDS pathophysiology. This hypothesis is reinforced by the fact that Treg number fluctuates according to disease stage. Given the effectiveness of immunosuppressive regimens in MDS and the encouraging results of the regulatory T-cell immunotherapy in solid neoplasms and autoimmune conditions, the findings of this study set the scene for the incorporation of the therapeutic manipulation of Tregs in MDS.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν ομάδα νοσημάτων που προέρχονται από κλωνική διαταραχή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και συνοδεύονται από ανοσολογικές ανωμαλίες. Πολλά στοιχεία, όπως η παρουσία αυτοάνοσων Τ κυτταρικών κλώνων και τα αυξημένα επίπεδα προ-αποπτωτικών κυτταροκινών, υποδεικνύουν ότι η ανοσιακή απορύθμιση, ιδιαίτερα στα πρώιμα στάδια των ΜΔΣ, επιφέρει την αυτοάνοση διεργασία στο μυελό των οστών. Η αυτοάνοση διεργασία καταλήγει σε αναποτελεσματική αιμοποίηση, σε περιφερικές κυτταροπενίες και, στο 30% των περιπτώσεων, σε συστηματική αυτοανοσία. Σε αντίθεση με τα πρώιμα στάδια, η εξέλιξη των ΜΔΣ χαρακτηρίζεται από διαφυγή του κακοήθους κλώνου από την ανοσοεπιτήρηση, γεγονός το οποίο υποβοηθά τη λευχαιμική εκτροπή. Τα CD4+CD25+FOXP3+ Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα (Τρυθ) διατηρούν την ανοσολογική ανοχή μέσω της ενεργού καταστολής της ανοσιακής απάντησης. Αυξημένα επίπεδα δραστικότητας των Τρυθ προστατεύουν από φαινόμενα αυτοανοσίας, παρεμποδίζουν όμως την ανοσοεπιτήρηση και την ανοσιακή απάντηση κατά του όγκου. Από την άλλη πλευρά, χαμηλά επίπεδα δραστικότητας των Τρυθ συσχετίζονται με την ανάπτυξη της αυτοανοσίας αλλά και με περισσότερο δραστική ανοσοεπιτήρηση. Η ταυτόχρονη συνύπαρξη κακοήθειας και αυτοανοσίας στα ΜΔΣ οδήγησε στην υπόθεση ότι αυτές οι διεργασίες μπορεί να είναι αποτέλεσμα μη φυσιολογικής ρύθμισης του ανοσοποιητικού συστήματος από τα Τρυθ. Δεδομένου του κεντρικού ρόλου που διαδραματίζουν τα κύτταρα αυτά στην ρύθμιση του ανοσοποιητικού καθώς και τη συμμετοχή του τελευταίου στην παθογένεια των ΜΔΣ, η μελέτη αυτή είχε σαν σκοπό να πραγματοποιήσει μια ενδελεχή διερεύνηση της δυναμικής και της λειτουργίας των Τρυθ σε ασθενείς με ΜΔΣ πρώιμου και όψιμου σταδίου, μελετώντας τον αριθμό και τη λειτουργικότητα των Τρυθ από το αίμα και το μυελό των οστών, όπως επίσης και τη μεταναστευτική τους ικανότητα. Τέλος, συσχετίστηκε ο αριθμός των Τρυθ με την εξέλιξη της νόσου. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Το ποσοστό και ο αριθμός των Tρυθ καθώς και η έκφραση του υποδοχέα CXCR4 μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής στο περιφερικό αίμα (ΠΑ) και μυελό των οστών (ΜΟ) ασθενών με πρώιμο στάδιο ΜΔΣ (π-ΜΔΣ, n=44) και όψιμο στάδιο ΜΔΣ (ο-ΜΔΣ, n=19). Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 28 αιματολογικά φυσιολογικοί δότες (ΦΔ), 14 από τους οποίους υπεβλήθησαν σε ορθοπαιδικά χειρουργεία. Η λειτουργικότητα των Tρυθ αξιολογήθηκε με δοκιμασίες καταστολής και πολλαπλασιασμού μετά από πολυκλωνική διέγερση με CD3/CD28 σφαιρίδια, απομονωμένων με μαγνητικά σφαιρίδια CD4+CD25- και CD4+CD25high κυττάρων. Οι κυτταροκίνες IFN-γ και TNF-α προσδιορίσθηκαν στα υπερκείμενα των δοκιμασιών καταστολής με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας την τεχνική CBA (Cytometric Bead Array), ενώ η συγκέντρωση της χημοκίνης CXCL12, συνδέσμου του CXCR4, και του TNF-α στο υπερκείμενο του μυελού των οστών (ΜΟ πλάσμα) μετρήθηκε με ELISA. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες χημειοταξίας προς ανθρώπειο CXCL12 ή ΜΟ πλάσμα. Η σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (One-Way ANOVA) ή το κατά ζεύγη Student’s t τεστ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το ποσοστό κα ο απόλυτος αριθμός των CD4+CD25+FOXP3+ κυττάρων (Τρυθ) στο ΠΑ όπως και το ποσοστό στο ΜΟ των ο-ΜΔΣ ασθενών παρουσίασαν υπερδιπλάσια αύξηση σε σχέση με τους π-ΜΔΣ ασθενείς και τους φυσιολογικούς δότες. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των π-ΜΔΣ ασθενών και των ΦΔ. Έκπτυξη των Τρυθ διαπιστώθηκε και κατά την εξέλιξη της νόσου, όπου ο απόλυτος αριθμός των Τρυθ στο ΠΑ ακολουθούσε τις αυξομειώσεις του λευχαιμικού φορτίου πριν και μετά την απάντηση στη χημειοθεραπεία. Τέλος, ο υποπληθυσμός των Τρυθ στα ο-ΜΔΣ που παρουσίασε αύξηση στο ΜΟ και το ΠΑ ήταν αυτός των «αθώων» CD45RA+ Τρυθ. Όσον αφορά τη λειτουργικότητα, τα Τρυθ στους π-ΜΔΣ ασθενείς παρουσίασαν ελαττωματική κατασταλτική ικανότητα. Συγκεκριμένα, τα εν λόγω κύτταρα αδυνατούσαν να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό αυτόλογων πολυκλωνικών Τ κυττάρων σε σύγκριση με αυτά των ΦΔ και των ο-ΜΔΣ σε ΜΟ και ΠΑ. Επιπλέον, η προκαλούμενη από τα Τρυθ αναστολή έκκρισης των κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α από τα Τ δραστικά κύτταρα επιβεβαίωνε τα αποτελέσματα των δοκιμασιών καταστολής. Τα Τρυθ των π-ΜΔΣ ασθενών εκδήλωναν σημαντικά ασθενέστερη αναστολή έκκρισης IFN-γ και TNF-α συγκριτικά με τα Τρυθ των ΦΔ και των ο-ΜΔΣ ασθενών, τόσο στο ΜΟ όσο και στο ΠΑ. Σχετικά με τη μεταναστευτική ικανότητα των Τρυθ, η έκφραση του CXCR4 στο ΠΑ ήταν μειωμένη στους π-ΜΔΣ ασθενείς σε σχέση με τους ΦΔ και τους ο-ΜΔΣ ασθενείς....