Επίδραση ανοσοτοξικών παραγόντων σε in vitro μοντέλο ανοσοποίησης

Abstract

Mycotoxins are fungal secondary metabolites that have been associated with severe toxic effects to humans and animals. The potential presence of mycotoxins in foods renders them a public health hazard and their toxicity needs to be better understood. In the present study we used human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to address the in vitro immuno-cytopathicity of two selected mycotoxins, Τ-2 toxin and Zearalenone (ZEA), as well as one neurotoxin Botulinum-Α (BoNT-A) (BOTOX). Here we report the effects of these toxins on the proliferation and cell death patterns of untreated or mitogen-activated PBMC. T-2 toxin is a type A trichothecene mycotoxin with high immunotoxicity. Investigating the effects of T-2 at sub-toxic (0.1ng/ml) and toxic (10ng/ml) levels on PBMC we observed no direct influence on untreated lymphocytes. In the phytohemagglutinin (PHA) - activated cultures, however, the toxic dose of T-2 totally inhibited the PHA-induced T cell proliferation and caused early apoptosis peaked 8 hours after exposure. Transient elevation of intracellular calcium ion levels (Ca2+) was noted, prior to apoptosis. The two main T lymphocyte subsets, CD4+ and CD8+, showed a positive response to T-2 at 8 hours followed by a sharp decline after 96 hours, which were confirmed by corresponding changes of naive (CD45RA+) and memory/effectors (CD45RO+) subpopulations. T-2 at sub-toxic doses appeared to exhibit co stimulatory properties to PHA-stimulated cells. These results suggest that the immunotoxicity of T-2 is related to the mechanism of activation-induced cell death (AICD) of T lymphocytes. ZEA is a non-steroidal estrogenic mycotoxin with a relatively low toxicity. We investigated the effects of ZEA at two limited concentrations (30μg/ml and 1μg/ml) on human PBMC. The higher concentration of 30μg/ml ZEA totally inhibited the T and B lymphocyte proliferation induced from PHA- and pokeweed mitogen (PWM) respectively. By examining the apoptosis and necrosis profiles using flow cytometry, we showed that ZEA exerted a distinct necrotic effect on PBMC, irrespective of mitogen stimulation, whereas apoptotic activity was less evident. Increased intracellular Ca2+ levels were observed only in the monocyte/granulocyte gated cells. Using the lysosomal inhibitors phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) and ammonium chloride, we demonstrated that ZEA-induced necrosis was inhibited by both PMSF at 0.05mM and ammonium chloride at 1 and 10mM, whereas apoptosis was less affected. Expose of PBMC to 1μg/ml ZEA did not alter the viability of the cells. Our results suggest that high ZEA concentrations in the blood can induce cytotoxic effects that merit further investigation. BOTOX, a neurotoxin Botulinum A, has become a standard therapy for many neurological disorders. In this study we examined the effects of BOTOX and tetanus neurotoxin on PBMC from patients who had been treated with BOTOX. We observed low immunotoxicity of BOTOX at tested doses, as were shown by the limited T- and B- cell responses and the absence of detectable antibodies cross-reacting with tetanus. However, exposure of both neurotoxins to PBMC from patients with anti-tetanus antibodies, BOTOX appeared to exert co stimulatory effect to tetanus-stimulated cells. Moreover, BOTOX affected the T lymphocyte subsets where we observed reduction of the naive (CD45RA+) subpopulation and an increase of the effectors/memory (CD45RO+) subpopulation at the same time. These observations indicate the need for a more detailed study on the effects of repeated use of BOTOX on the immune system. The results from this study provide useful information about the mechanisms by which mycotoxins and BOTOX can affect the immune system and induce immunotoxicity, providing potential on effective management and treatment of these toxins

Οι μυκοτοξίνες είναι δευτερογενείς μεταβολίτες των μυκήτων που σχετίζονται με δριμύτατες τοξικολογικές επιδράσεις τόσο στα ζώα όσο και στον άνθρωπο. Η δυναμική παρουσία των μυκοτοξινών στα τρόφιμα τις καθιστά κίνδυνο δημόσιας υγείας και η τοξικότητα τους χρειάζεται να προσδιοριστεί καλύτερα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσουμε την πιθανή κυτταρο-παθητική δράση δύο επιλεγμένων μυκοτοξινών, της Τ-2 τοξίνης και της Zearalenone (ZEA), καθώς επίσης και της νευροτοξίνης Botulinum-Α (BoNT-A) (BOTOX), σε ανθρώπινα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα αίματος (PBMC) in vitro. Η Τ-2 τοξίνη, είναι μια τριχοθεσίνη τύπου Α μυκοτοξίνη η οποία εκθέτει υψηλή ανοσοτοξική δράση. Εξετάζοντας την επίδραση της Τ-2 σε υποτοξικά (0.1ng/ml) και τοξικά (10ng/ml) επίπεδα στα PBMC, δεν παρατηρήσαμε άμεση επίδραση της τοξίνης σε μη διεγερμένα λεμφοκύτταρα. Η τοξική δόση της τοξίνης, πάντως, ανέστειλε πλήρως τον επαγόμενο από την phytohemagglutinin (PHA) πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και προκάλεσε πρώιμη απόπτωση η οποία κορυφώθηκε 8h μετά την έκθεση στην τοξίνη. Παροδική αύξηση στα επίπεδα των ενδοκυτταρικών ιόντων ασβεστίου (Ca2+) παρουσία της Τ-2 παρατηρήθηκε πριν την επαγωγή της απόπτωσης. Και οι δύο μεγαλύτεροι Τ λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί, CD4+ και CD8+, επηρεάστηκαν καθώς έδειξαν μια θετική απόκριση στην Τ-2 μετά από 8h ακολουθούμενη από απότομη μείωση αυτών μετά από 96h. Περαιτέρω έρευνα των παρθενικών (CD45RA+) και των αναμνηστικών (CD45RO+) υποπληθυσμών επιβεβαίωσαν τις παρατηρήσεις αυτές. Η υποτοξική δόση της Τ-2 φάνηκε να εκθέτει συν-διεγερτικές ιδιότητες στα διεγερμένα με PHA κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η Τ-2 επηρεάζει τον μηχανισμό του επαγόμενου από ενεργοποίηση κυτταρικού θανάτου των Τ λεμφοκυττάρων. Η ΖΕΑ είναι μία μη-στεροειδής οιστρογονική μυκοτοξίνη χαμηλής σχετικά τοξικότητας. Η ανοσοκυτταροπαθητική δράση της ΖΕΑ στα ανθρώπινα PBMC μελετήθηκε σε δύο οριακές συγκεντρώσεις των 30μg/ml και 1μg/ml. Στην υψηλότερη συγκέντρωση των 30μg/ml ZEA παρατηρήθηκε πλήρης αναστολή του Τ και Β λεμφοκυτταρικού πολλαπλασιασμού μετά από ενεργοποίηση με PHA και pokeweed mitogen (PWM) αντίστοιχα. Η ανασταλτική επίδραση της ZEA συσχετίστηκε περαιτέρω με την κυτταρική νέκρωση και απόπτωση. Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής έδειξε σαφή νεκρωτική δράση της ΖΕΑ στα PBMC, ανεξάρτητα από μιτογόνο διέγερση, ενώ η αποπτωτική δραστηριότητα ήταν λιγότερο εμφανής. Αύξηση στα επίπεδα του ενδοκυτταρικού Ca2+ παρουσία της ΖΕΑ παρατηρήθηκε μόνο στην πύλη των μονοκυττάρων/κοκκιοκυττάρων πολυμορφοπύρηνων κυττάρων. Χρησιμοποιώντας δύο λυσσοσωμικούς αναστολείς νέκρωσης, το phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) και το χλωριούχο αμμώνιο, δείξαμε ότι το PMSF σε συγκέντρωση 0.05mM και το χλωριούχο αμμώνιο σε 1 και 10mM μείωσαν την κυτταροπαθητική νέκρωση που επάγεται από 30μg/ml ZEA, ενώ η απόπτωση επηρεάστηκε λιγότερο...