Συγκριτική μελέτη ανάλυσης πολύπλοκων δειγμάτων και θεωρητική προσέγγιση χρωματογραφικών παραμέτρων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) με τη χρήση μεμονωμένων στηλών και συνδυασμού αυτών

Abstract

In the present work, emphasis has been given on estimation of critical chromatographic parameters on two-column silica-based serially linked systems in isocratic reversed-phase (RP) and non-aqueous reversed-phase (NARP) HPLC. It has been common practice in various chromatographic procedures to connect two or more columns in series in order to increase separation efficiency or to change selectivity and separate a number of compounds in complex mixtures avoiding complicated instrumentation. For this purpose, retention time (tR), peak width (w), resolution (Rs), number of theoretical plates (N), capacity factor (k/) and separation factor (α) were studied in several experiments. The values of the above chromatographic parameters measured experimentally with two columns in series seemed to deviate, considerably in some cases, from those calculated by the basic chromatographic theoretical equations, while they were in good agreement with those estimated by the derived empirical equations. These equations could be a very useful tool for the prediction of the separation performance of a two-column serial system, based on separation on the individual columns. Thus, they could serve as a significant guide to whether or not such a choice would improve the separation attempted. At the same time the temperature effect on these empirical equations has been investigated in both isocratic reversed-phase and non-aqueous reversed-phase high performance liquid chromatography. Finally, the retention mechanism in reversed-phase liquid chromatography has been examined over a temperature range, with emphasis on the observed differences using individual columns and columns in series. Van’t Hoff plot shapes were used to assess the retention mechanisms and to estimate the indications of the hydrophobic interactions between mobile phase and solutes or the partitioning model of retention.

Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε μελέτη και εκτίμηση σημαντικών χρωματογραφικών παραμέτρων, όταν δυο στήλες συνδέονται εν σειρά και συσχέτιση τους με τα δεδομένα στις μεμονωμένες χρωματογραφικές στήλες. Η αύξηση της απόδοσης μιας στήλης και η βελτίωση του διαχωρισμού, είναι εφικτό να επιτευχθούν όταν δυο χρωματογραφικές στήλες συνδέονται εν σειρά καθιστώντας δυνατή την ανάλυση εξαιρετικά πολύπλοκων δειγμάτων. Οι παράμετροι που εξετάστηκαν είναι: ο χρόνος ανάσχεσης (retention time, tr), το εύρος κορυφής (peak width, w), η διαχωριστότητα (resolution Rs), ο αριθμός θεωρητικών πλακών (column efficiency, N), ο παράγοντας διαχωρισμού (separation factor, α) και ο παράγοντας χωρητικότητας (separation factor k΄). Η πρόβλεψη των παραπάνω χρωματογραφικών παραμέτρων σε συστήματα στηλών εν σειρά, πραγματοποιήθηκε με την εξαγωγή εμπειρικών εξισώσεων τόσο στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, όσο και στην περίπτωση της μη υδατικής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στις χρωματογραφικές παραμέτρους όταν δυο στήλες συνδέονται εν σειρά είτε επρόκειτο για τη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης είτε για την περιπτωση της μη υδατικής χρωματογραφίας. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε προσέγγιση των μηχανισμών ανάσχεσης στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης με βάση την εξάρτηση του χρόνου ανάσχεσης και πιο συγκεκριμένα του παράγοντα χωρητικότητας, από τη θερμοκρασία, εστιάζοντας στις παρατηρούμενες διαφορές κατά τη χρήση μιας μεμονωμένης χρωματογραφικής στήλης και δυο στηλών συνδεδεμένων εν σειρά. Για το σκοπό αυτό, διαγράμματα Van’t Hoff, lnk΄(1/Τ) κατασκευάστηκαν για όλους τους αναλύτες σε όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, εκτιμώντας κάθε φορά τις ενδείξεις του μηχανισμού των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ή του μηχανισμού της κατανομής του αναλύτη μεταξύ της υδρόφιλης κινητής και της υδρόφοβης στατικής φάσης.