Ανίχνευση του ιού της ευλογιάς του προβάτου με τη βοήθεια τεχνικών μοριακής βιολογίας

Abstract

Because of the geographical position of Greece, bordering with European and Asian countries, different exotic diseases could potentially appear. Indeed, during the last few years sheeppox virus outbreaks occured in regions close to eastern borders.Since a rapid and specific diagnostic method for sheeppox virus detection is lacking we decided to carry out the present investigation. The aim was to establish an effective, fast and specific laboratory diagnostic procedure.The method of choice was the polymerase chain reaction (PCR).In the present thesis, sheeppox virus and the disease it causes, the epidemiological data for the last 1 7th years in the country and four experiments for the PCR establishment are described.In the first experiment a simple, rapid and specific diagnostic polymerase chain reaction method for sheeppoxvirus identification and differentiation from related viruses was developed. The primers that were used were developed from the sequenced genomes of the capripox viruses KS-1 and InS-l. Six different sheeppox isolates were tested against two orf viruses (parapox), one myxoma virus(/epor/pox) and two animal herpesviruses as controls. Material from uninfected cell cultures was also used as control.The sensitivity of PCR was similar with both primers and for all sheeppox isolates. All negative control virus DNAs were negative and clearly differentiated from those of the sheeppox strains. In the second experiment, PCR was applied for the earliest possible sheeppox virus detection and identification in cell cultures inoculated with clinical specimens. Seventeen skin samples with lesions suspected of sheeppox were examined. They were ground, passaged and titrated in primary lamb testis (LT) cell cultures. As negative controls, five skin samples with orf virus lesions and three skin biopsies from normal sheep were examined. The established greek isolates of sheeppox virus strain 281 and orf virus strain 1 76 were also included. PCR for sheeppoxvirus was positive on the first day of the first passage for all clinical specimens, whereas cytopathogenic effect appeared on the 2nd to 5th post inoculation days of the first, second or third passages. The identification of all isolates was made by VNT, using homologous and heterologous antisera. Thus the virus isolation and identification by VNT took from 15 to 30 days. PCR was negative with all control samples. These results indicate that PCR can be used for an early and specific identification of sheeppox virus in field samples after inoculation in LT cells.In the third experiment a comparative study was conducted to investigate the sensitivity of four diagnostic procedures for sheeppox identification. Forty clinical specimens of skin lesions from sheeppox suspected sheep were tested by PCR, virus isolation in LT cells, direct immmunofluorescent assay (DIFA) and antigen detecting agar gel immunoprécipitation test (AGIPT).All specimens were positive by PCR and virus isolation, 29 by DIFA and 16 by AGIPT. PCR proved to be equally sensitive to virus isolation in LT cell cultures (100%), whereas DIFA and AGIPT showed a sensitivity of 73% and 40% respectively.Skin samples with orf lesions or normal skin biopsies were PCR negative. Cross-reactions with orf virus were observed in three samples only in the AGIPT assay.The described PCR method combines high specificity, high sensitivity and speed. Therefore it is the method of choice for sheeppox virus diagnosis directly from clinical specimens.In the fourth experiment, the development of a multiplex polymerase chain reaction method with amplification of capripoxvirus in asingle-step procedure from skin biopsies using three primer pairs, two specifics for capripoxvirus and one specific for oi-tubulin is described. False negative results that sometimes arise due to inhibitors of DNA amplification are avoided by the inclusion of a-tubulin primers in the assay.The results reported on 42 skin biopsies from sheep suspected to have poxvirus infection, indicated that the assay could monitor simultaneously DNA extraction from skin biopsy samples and allow improved detection of capripoxvirus within 24 hours of specimen receiptin the laboratory.

Λόγω της γεωγραφικής θέσης της χώρας μας ανάμεσα στην Ευρώπη στην Ασία και στην Αφρική εμφανίζονται κατά καιρούς διάφορα εξωτικά νοσήματα. Τα τελευταία χρόνια είχαμε αρκετά συχνά κρούσματα ευλογιάς του προβάτου σε διάφορες περιοχές, κυρίως κοντά στα ανατολικά σύνορα. Κάθε φορά που συνέβαινε αυτό η χώρα μας εκαλείτο από την Ευρωπαϊκή Ένωση να απαντήσει γρήγορα και επακριβώς εάν πράγματι τα ύποπτα κρούσματα ήταν ευλογιά και να λάβει τα κατάλληλα μέτρα αφού το νόσημα θεωρείται εξωτικό για τις Ευρωπαϊκές χώρες.Όμως οι διαθέσιμες εργαστηριακές διαγνωστικές μέθοδοι για την ευλογιά είναι ανεπαρκείς κατά το ότι είναι χρονοβόρες και μη ειδικές αφού έχουν μικρή ευαισθησία και δίνουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλους σχετικούς νοσογόνους παράγοντες. Έτσι, προέκυψε η ανάγκη έρευνας για την καθιέρωση ειδικής και ταχείας μεθόδου διαπίστωσης του ιού της ευλογιάς σε δείγματα παθολογικών υλικών. Με την παρούσα διατριβή δημοσιεύονται τα αποτελέσματά της. Ως μέθοδος επιλέχθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR).Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται το νόσημα της ευλογιάς του προβάτου, ο αιτιολογικός παράγοντας και τα επιζωοτιο- λογικά στοιχεία της χώρας μας τα τελευταία 1 7 χρόνια. Στη συνέχεια εκτίθενται οι διαδοχικές ερευνητικές εργασίες που πραγματοποιήθηκαν ώστε να καθιερωθεί η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ως η ειδική δοκιμή για τη διάγνωση της ευλογιάς.Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν τέσσερεις ερευνητικές εργασίες (πειράματα). Στην πρώτη αναπτύχθηκε μία ειδική PCR για την ανίχνευση του ιού της ευλογιάς από καθαρή καλλιέργεια καθιερωμένων στελεχών. Τα εκκινητικά μόρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από περιοχές του γενώματος δύο στελεχών ευλογιάς, του KS- 1 και InS-l. Ελέχθηκαν έξι διαφορετικά στελέχη ευλογιάς. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη λοιμώδους εκθύματος, ένα στέλεχος ιού μυξωμάτωσης, δύο ερπητοϊοί ζώων και κύτταρα μη ενοφθαλμισμένα. Η ευαισθησία της PCR ήταν σχεδόν ίδια με τα δύο ζεύγη εκκινητικών μορίων και για τα έξι στελέχη ευλογιάς. Ό-λοι οι μάρτυρες έδιναν αρνητική αντίδραση στην PCR και διαφοροποιούνταν σαφώς από τα στελέχη της ευλογιάς.Στη δεύτερη εργασία η PCR εφαρμόσθηκε σε ενοφθαλμισμένες με παθολογικά υλικά κυτταροκαλλιέργειες, με στόχο την όσο το δυνατό ταχύτερη ανίχνευση του ιού. Εξετάσθηκαν 17 δείγματα δέρματος προβάτων με αλλοιώσεις ύποπτες ευλογιάς. Τα δείγματα λειοτριβήθηκαν και στη συνέχεια ενοφθαλμίστηκαν και τιτλοποιήθηκαν σε κυτταροκαλλιέργειες όρχεων αμνού. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν πέντε δείγματα δέρματος προβάτων με αλλοιώσεις λοιμώδους εκθύματος και τρία δείγματα δέρματος από υγιή ζώα. Εξετάσθηκαν, επίσης, το ελληνικό στέλεχος 281 της ευλογιάς του προβάτου, ως θετικός μάρτυρας, και το ελληνικό στέλεχος 1 76 του λοιμώδους εκθύματος, ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα ύποπτα ευλογιάς δείγματα ήταν θετικά στην PCR από την πρώτη ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό της πρώτης διόδου, δηλαδή σε 24-48 ώρες. Αντίθετα, το κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα εμφανιζόταν την 2π έως 5^ ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό της πρώτης, δεύτερης ή τρίτης διόδου. Η απομόνωση δηλαδή, του ιού σε κυτταροκαλλιέρ- γειες και η ταυτοποίηση του, διαρκούσαν 1 5 έως 30 ημέρες. Στους αρνητικούς μάρτυρες δεν παρατηρήθηκε θετικό αποτέλεσμα με την PCR. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την γρήγορη και ειδική διάγνωση του νοσήματος από ενοφθαλμισμένα με παθολογικά υλικά κύτταρα όρχεων αμνού.Στην τρίτη εργασία, σαράντα δείγματα δέρματος με αλλοιώσεις ύποπτες ευλογιάς εξετάσθηκαν με τέσσερεις διαγνωστικές μεθόδους, την PCR, την απομόνωση του ιού σε κύτταρα, τον άμεσο ανοσοφθορισμό και την ανοσοδιάχυση. Όλα τα δείγματα ήταν θετικά στην PCR και στην απομόνωση του ιού. Εικοσιεννέα ήταν θετικά στον ανοσοφθορισμό και δεκαέξι στην ανοσοδιάχυση. Δεδομένου ότι η απομόνωση του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες είναι η ασφαλέστερη τεχνική διάγνωσης διαπιστώθηκε ότι η ευαισθησία της PCR ήταν 100%, η του ανοσοφθορισμού 73% και της ανοσοδιά- χυσης 40 %. Τα δείγματα δέρματος με αλλοιώσεις λοιμώδους εκθύματος και εκείνα από τα υγιή ζώα ήταν αρνητικά στην PCR. Διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον ιό του λοιμώδους εκθύματος παρατηρήθηκαν σε τρεις περιπτώσεις, μόνο με την τεχνική της ανο-σοδιάχυσης. Η PCR αποδείχθηκε ότι είναι η μέθοδος εκλογής για την άμεση διάγνωση του νοσήματος από παθολογικά υλικά.Στην τέταρτη εργασία, αναπτύχθηκε η πολλαπλή PCR. Το παθολογικό υλικό εξετάζονταν ταυτόχρονα με τρία ζεύγη εκκινη- τικών μορίων, δύο ειδικών για την ευλογιά και ένα για την α- tubulin. Υευδώς αρνητικά δείγματα, που είναι δυνατόν να εμφανισθούν λόγω κακής εκχύλισης του DNA του δείγματος ή ύπαρξης αναστολέων της επέκτασης του DNA, μπορούν να αποκλεισθούν με την προσθήκη των εκκινητικών μορίων για την α- tubulin. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την εξέταση 42 παθολογικών υλικών ύποπτων ευλογιάς, έδειξαν ότι η πολλαπλή PCR μπορεί να ανιχνεύσει το ιικό DNA από τα παθολογικά υλικά, αποκλείοντας πιθανές περιπτώσεις λάθους.Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι με την εφαρμογή της PCR, και ιδιαίτερα της πολλαπλής PCR, είναι δυνατή η διάγνωση της ευλογιάς και η διάκρισή της από το λοιμώδες έκθυμα μέσα σε 24 ώρες από την παραλαβή του παθολογικού υλικού από το εργαστήριο, σε αντίθεση με τις 1 5-30 ημέρες που χρειαζόταν με τις ως τώρα γνωστές μεθόδους διάγνωσης.