Λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση των αδενικών τριχών του γένους Cistus: κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός της συνθάσης των διτερπενίων

Abstract

Cistus creticus ssp creticus is an indigenous shrub of the Mediterranean basin. Its resinous leaves contain glandular trichomes that excrete the characteristic resin, rich in labdane-type diterpenes with antibacterial and inhibitory activity against growth of leukemian cell cultures in vitro. Chemical analysis of trichomes isolated from leaves of different developmental stages revealed that labdane-type diterpenes accumulate and are excreted in higher concentrations in young leaves. A young-leaf enriched trichome-specific cDNA library was constructed and 2022 expressed sequence tags (ESTs) were subsequently isolated, sequenced and annotated. Secondary metabolism in C. creticus ssp creticus trichomes was represented by 4% of total transcripts mainly involved in flavonoid and terpenoid metabolism, among them five cDNA clones with significant homologies to terpene synthases genes. Heterologous expression and functional characterization of these cDNAs confirmed that they encode for terpene synthases, which catalyzed the production of multiple products. One of the enzymes was found to be bifunctional and catalyzed in the first step the convertion of geranyl-geraniol diphosphate into labd-13-en-8a-15-diol diphosphate and in the second step the production of manoyl oxides and one more labdane type diterpene present in Cistus creticus ssp. creticus resin giving new insights in the biosynthetic pathway leading to this category of terpenes. The other enzymes corresponded to sesquiterpene synthases and were named after their major product as β-caryophyllene synthase, β-farnesene synthase, germacrene B synthase and E-nerolidol synthase. Remarkably, a significant proportion of the ESTs (38%) displayed no significant similarity to any other DNA or protein sequence of known function in existing databases, indicating a yet unknown function. These clones are putative candidates of novel genes exclusively or preferentially expressed in trichomes. With regard to the latter, RT-PCR analysis confirmed the preferential expression of 8 genes in trichomes. Initial identification of such trichome-specific genes was done through the application of microarray analysis via another project in lab. Within these genes was the germacrene B synthase gene mentioned earlier. Thus, this study revealed, for the first time, a trichome - specific expression for a sesquiterpene synthase gene.

To Cistus creticus ssp. creticus είναι ένα φυτό της Μεσογειακής βλάστησης, η χαρακτηριστική ρητίνη «λάδανο» του οποίου έχει μέχρι σήμερα συγκεντρώσει το επιστημονικό ενδιαφέρον κυρίως από φαρμακογνωστική και φαρμακολογική άποψη εξαιτίας της αντιμικροβιακής και αντινεοπλασματικής δράσης των τερπενικών της συστατικών και κυρίως των λαβδανικών της διτερπενίων. Η χημική ανάλυση απομονωμένων τριχωμάτων από φύλλα διαφορετικού αναπτυξιακού σταδίου ανέδειξε τα νεαρά φύλλα του φυτού ως τα πλουσιότερα σε τερπενικά συστατικά και κυρίως λαβδανικά διτερπένια. Η cDNA βιβλιοθήκη που δημιουργήθηκε από τα τριχώματα των φύλλων ήταν εμπλουτισμένη σε μετάγραφα αυτού του αναπτυξιακού σταδίου. Η αλληλούχηση 2022 τυχαία επιλεγμένων κλώνων της παραπάνω βιβλιοθήκης οδήγησε στην αναγνώριση γονιδίων που σχετίζονται με το δευτερογενή μεταβολισμό και κυρίως με τις βιοσυνθετικές οδούς των τερπενίων και των φλαβονοειδών που αντιστοιχούσαν στο 4% του συνόλου των κλώνων. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός πέντε cDNA κλώνων εξ’ αυτών με σημαντική ομοιότητα με συνθετάσες τερπενίων έδειξε ότι ένας από τους κλώνους κωδικοποιεί για συνθετάση οξειδίων της μανοόλης που καταλύει δύο διαδοχικές κυκλοποιήσεις. Η πρώτη κυκλοποίηση οδηγεί στο σχηματισμό ενός ενδιάμεσου σταθερού μορίου, της πυροφωσφορικής λαβδ-13-εν-8a-15-διόλης, και η δεύτερη στα δύο ισομερή του οξειδίου της μανοόλης και ενός ακόμη λαβδανικού διτερπενίου τα οποία αποτελούν κύρια συστατικά της ρητίνης του φυτού. Οι υπόλοιποι τέσσερις κλώνοι κωδικοποιούν για συνθετάσες σεσκιτερπενίων και ειδικότερα για τις συνθετάσες του β-φαρνεσενίου, του β-καρυοφυλλενίου, του γερμακρενίου Β και της νερολιδόλης. Ένα σημαντικό ποσοστό των υπόλοιπων κλώνων (38%) της EST ανάλυσης χαρακτηρίστηκαν ως άγνωστης λειτουργίας. Τμήμα των κλώνων αυτών αντανακλούν την εξειδικευμένη λειτουργία των τριχωμάτων και πιθανά εκφράζονται αποκλειστικά ή κυρίως σε αυτό τον ιστό. Στα πλαίσια ενός άλλου έργου του εργαστηρίου η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων της cDNA βιβλιοθήκης σε μικροσυστοιχίες έδειξε ότι οχτώ από αυτά είχαν πιθανή αποκλειστική έκφραση στα τριχώματα. Πειράματα ημιποσοτικοποιημένης έκφρασης (RT-PCR) για την επιβεβαίωση των παραπάνω αποτελεσμάτων κατέδειξε το γονίδιο της συνθετάσης του γερμακρενίου Β ως αποκλειστικά εκφραζόμενο στα τριχώματα.