Μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν τη δημιουργία και τη διαφοροποίηση των τριχωμάτων στα φύλλα του Cistus creticus subsp. creticus.

Abstract

Cistus creticus subsp. creticus is a characteristic plant of the Mediterranean ecosystem whose resin exhibits pharmacologically interesting properties. The resin is secreted by the glandular trichomes of the leaf epidermis and contains labdane type diterpenes with antibacterial and inhibitory activity against growth of leukemian cell cultures. Leaf epidermal cells differentiate into trichomes under the control of the key transcriptional regulator TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1), in Arabidopsis thaliana. The homologue CcTTG1 full length cDNA from C. creticus was isolated. Transcripts accumulation was detected in all tested tissues with higher levels in vegetative ones. Upon phylogenetic analysis, CcTTG1 groups with known TTG1 regulators of the trichome initiation. The glabrous phenotype of the loss of function A. thaliana ttg1 mutants was restored upon transformation with the CcTTG1. The gene was also able to restore the seed coat pigmentation defect of the mutant. Total RNA from leaves of C. creticus were used for the construction of a cDNA library, which was screened along with an existing trichome-specific cDNA library for interactors of the CcTTG1 protein. The yeast two-hybrid screen resulted in the identification of seven CcTTG1 interactors. Four of them were further analyzed using the yeast-two-hybrid system. Three protein-protein interactions were tested in planta, using a transient expression system in tobacco epidermal cells. The analysis was based on the Bi-molecular Fluorescent Complementation (BiFC) and verified the interaction of CcTTG1 with two Squamosa promoter Binding Proteins (SBP). Also the interactions were detected in the nucleus of the tobacco epidermal cells. We report the first protein-protein interaction of the SBP family of transcription factors and a novel interaction of the TTG1 protein.

To Cistus creticus subsp. creticus είναι ένα φυτό του μεσογειακού οικοσυστήματος το οποίο συγκεντρώνει το επιστημονικό ενδιαφέρον χάρη στις φαρμακευτικές ιδιότητες της ρητίνης του. Η ρητίνη ή λάδανο παράγεται στα τριχώματα των φύλλων του C. creticus και περιέχει συστατικά όπως λαβδανικά διτερπένια με αντιμικροβιακές και αντινεοπλασματικές ιδιότητες. Τα τριχώματα του φυτού αναπτύσσονται από διαφοροποιούμενα επιδερμικά κύτταρα του φύλλου. Το γονίδιο TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1) όπως έχει αποδειχθεί στο μοντέλο φυτό Arabidopsis thaliana, αποτελεί κεντρικό μεταγραφικό ρυθμιστή της τριχογένεσης. Το ομόλογο γονίδιο CcTTG1 από το C. creticus απομονώθηκε και η συσσώρευση των μεταφράφων του ανιχνεύτηκε σε όλους τους ιστούς με μεγαλύτερη ένταση στους βλαστικούς. Κατά τη φυλογενετική ανάλυση το CcTTG1 ομαδοποιήθηκε με γνωστούς TTG1 ρυθμιστές της τριχογένεσης. Μεταλλάγματα A. thaliana ttg1 τα οποία δε φέρουν τριχώματα, παρουσίασαν ανάπτυξη τριχωμάτων στην επιφάνεια των φύλλων τους μετά από γενετική τροποποίηση με το γονίδιο CcTTG1. Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά παρουσίασαν επαναφορά της ικανότητας χρώσης του σπερματικού περιβλήματος, η οποία αποτελεί άλλη μια αποδεδειγμένη πλειοτροπική δράση της TTG1. Κατασκευάστηκε μια cDNA βιβλιοθήκη από φύλλα του C. creticus και με «δόλωμα» την πρωτεΐνη CcTTG1, σαρώθηκε για πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις μαζί με μια cDNA βιβλιοθήκη από τριχώματα του ίδιου φυτού. Η σάρωση έγινε σε σύστημα δύο υβριδίων του σακχαρομύκητα και απέφερε εφτά αλληλεπιδράσεις με την CcTTG1. Τέσσερις από αυτές αναλύθηκαν εκτενέστερα στο σύστημα δύο υβριδίων εκ των οποίων τρεις δοκιμάστηκαν σε in planta σύστημα, με παροδική έκφραση σε επιδερμικά κύτταρα καπνού. Η εφαρμογή της δι-μοριακής συμπλήρωσης φθορισμού στα κύτταρα του καπνού οδήγησε στην αναγνώριση της αλληλεπίδρασης της CcTTG1 με δύο μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας SBP (Squamosa promoter Binding Proteins). Οι δύο αλληλεπιδράσεις εντοπίζονται στον πυρήνα. Πρόκειται για την πρώτη αναφορά πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης στην οποία συμμετέχει μια πρωτεΐνη της οικογένειας των SBP. Επίσης προτείνεται για πρώτη φορά η συνεργασία της TTG1 με μέλος της οικογένειας SBP.