Μελέτη κυτταρικής αντίδρασης στην τροποποιούμενη - με βιοπολυμερή ικριώματα - επιφάνεια οδοντιατρικών κεραμικών υλικών

Abstract

Tissue engineering is a quite promising science at the area of tissue regeneration. Scaffolds are commonly used in tissue engineering in order to provide a friendly micro-environment for 3D cell development. They have been used in soft and hard tissue development, commonly in medical practice. In dentistry, scaffolds have been used at periodontal regeneration and implantology. Moreover, in tissue engineering bioactivity and biocompatibility of materials is of great importance. Dental ceramic although is considered biocompatible, is incapable of interacting with the surrounding tissues. Bioactive modification of dental ceramic discs is already investigated. Coatings of bioactive glass – ceramic (1:1 wt), ceramic (50%), HAp (35%) and bioactive glass s (15%) (in system SiO2 45%, Na2O 24,5%, CaO 24,5%, P2O5 6%) and ceramic (50%), Al2O3 (7,5%) and bioactive glass (42,5%) were made. Furthermore, bioactivity of bioactive glass and hydroxyapatite (HAp) is well established, while in HAp is reported to be more chemically stable compared to bioactive glass. Moreover, materials like Al2O3 may reinforce dental porcelain and improve mechanical properties. Cell proliferation and morphology were investigated with scanning electron microscopy. Ceramic discs with coating of ceramic and bioglass (1:1) seem to benefit compared to all others. On these specimens, an HCAp film is developed at day 15th. Besides, Ca–P aggregates were observed at the surface. Overall, it could be concluded that the presence of Ca–P aggregates on the cells’ surface, enhances the hypothesis that PDLC interactions with modified ceramics might trigger the growth of such aggregates, while a network consisting of cells and Ca-P aggregates is continuously developing. Biopolymer scaffolds attached on bioactive glass modified dental ceramics could act as vehicles, in order to guide periodontal ligament cell (PDLC) proliferation and finally tissue development. This could have a beneficial effect on long term prognosis of fixed restorations. The aim of this study was to investigate the optimum proliferation pattern of human PDLC on composite scaffolds (chitin/chitosan/chitosan-gelatin), attached on bioactive glass modified dental ceramics. Three types of scaffolds were used: made of chitin, chitosan and chitosan – gelatin, with pore size 120- 250μm. They were fabricated thhrough Particulate leaching, supercritical CO2 foaming and Critical Point Drying, on the surface of ceramic disks, being coated with a mixture of bioactive glass – ceramic (1:1 wt) and thermally treated. The mostly used method, was Particulate leaching, in all cases. Composite scaffolds were incubated at 370C up to 15 days on well plates, either with culture medium (DMEM supplemented with 10% FCS) or with culture medium in the presence of 105 cells PDLC. To evaluate cell proliferation the MTS technique (Aqueous Non – Radioactive Cell proliferation assay, Promega) was used. Cell proliferation was evaluated at 1, 3, 7, 10 and 15 days. Finally, optical density (OD) was measured at a test wavelength of 490 nm and a reference wavelength of 630 nm. MTS assay. OD values of day 1 confirmed the presence of cells at all scaffolds. In cases of CHN and CHS, the number of attached cells was progressively decreasing, while the rate of cell death was significantly higher for CHN. On the contrary, proliferation rate on CH-G presented a peak after 7 days, a slowdown until day 12 and then attained a constant rate until the end of the experiment. In conclusion, all 3 types of examined composites ceramic-scaffolds were successfully loaded with PDL cells. However, only in CH-G composites ceramic-scaffolds the human PDL cells proliferated, then decreased and finally remained stable, while in case of CHN and CHS the number of cells was progressively decreasing. The successful cellular response could support the development of a protocol for tissue engineering on the materials used.

Η ιστομηχανική είναι μια ταχέως εξελισσόμενη επιστήμη. Εφαρμογές της έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλούς τομείς της ιατρικής. Συνήθως, χρησιμοποιούνται μοσχεύματα, αλλά και μεμβράνες και ικριώματα για την ανάπλαση ιστών και οργάνων. Τα ικριώματα, όπως ήδη έχει αναφερθεί, λειτουργούν ως οχήματα μεταφοράς και ανάπτυξης κυττάρων. Διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες με βάση τον ρυθμό απορρόφησης , τη σύνθεσή τους και τη δομή τους. Έτσι, υπάρχουν ικριώματα μόνιμα και προσωρινά, φυσικά, συνθετικά συνδυασμός φυσικών – συνθετικών ικριωμάτων και τέλος πορώδη και ινώδη. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε καταρχήν η δυνατότητα τροποποίησης -με βιοενεργείς επιστρώσεις- της επιφάνειας οδοντιατρικού κεραμικού βάθρου, η παρασκευή βιοπολυμερών ικριωμάτων στην τρποποιημένη επιφάνεια και τελικά η κυτταρική ανταπόκριση κυττάρων περιοδοντικού ιστού σε τρεις κατηγορίες σύνθετων υλικών (κεραμικά δοκίμια-βιοπολυμερή ικριώματα): α) κεραμικό δοκίμιο- ικρίωμα χιτίνης, β) κεραμικό δοκίμιο- ικρίωμα χιτοζάνης και γ) κεραμικό δοκίμιο – ικρίωμα χιτοζάνης ζελατίνης, με απώτερο στόχο την αναγέννηση περιοδοντικού ιστού στην κρίσιμη περιοχή του αυχενικού ορίου ακίνητων προσθετικών αποκαταστάσεων. Αυτό αποτελεί και την καινοτομία στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Η επίτευξη του παραπάνω στόχου θα συνέβαλε ουσιαστικά στη βελτίωση της πρόγνωσης Ακίνητων Προσθετικών Αποκαταστάσεων, επειδή η δευτερογενής τερηδόνα αποτελεί συχνή επιπλοκή. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται τροποποίηση της επιφάνειας κεραμικών δοκιμίων με βιοενεργείς επιστρώσεις (Κοκοτή και συν. 2001, Κοντονασάκη 2003). Διερευνήθηκε περαιτέρω η δυνατότητα βελτίωσης της τροποποίησης της επιφάνειας με προσθήκη στα μίγματα επιστρώσεων χημικού υδροξυαπατίτη (HΑp) και αλουμίνας (Al2ο3). Πραγματοποιήθηκε εμβάπτιση των δοκιμίων σε διάλυμα που προσομοιάζει τα υγρά του σώματος, αλλά και θρεπτικό μέσο καλλιέργειας κυττάρων( DMEM). Έχοντας ως κριτήρια την έναρξη σχηματισμού υδροξυκαρβονικού απατίτη, αλλά και την παρουσία κυττάρων στις επιφάνειες, επιλέχθηκε η επίστρωση με κατά βάρος αναλογία κεραμικού– βιοενεργής υάλου 1:1. Ακόμη, παρασκευάστηκαν ικριώματα σε επαφή με τις επιφάνειες των τροποποιημένων δοκιμίων. Οι τρόποι παρασκευής που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: απομάκρυνση σωματιδίων (Particulate leaching), αφρισμός με χρήση CO2 υψηλής πίεσης και ξήρανση κρίσιμου σημείου (Critical Point Drying). Κυρίως εφαρμόστηκε η πρώτη μέθοδος με τη χρήση μη υδατοδιαλυτών σωματιδίων. Οι πόροι , δε, ήταν ανοικτοί και η κατανομή τους ομοιόμορφη, όπως διαπιστώθηκε, τόσο από τον προσδιορισμό του πορώδους και του μεγέθους των πόρων με τη βοήθεια μικροφωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (SEM). Το μέγεθος, δε, των πόρων ήταν 120- 250μm. Η σύνδεση των ικριωμάτων με την τροποποιημένη επιφάνεια δοκιμίου, παρατηρείται σε όλη σχεδόν την επιφάνεια στις μικροφωτογραφίες SEM Οφείλεται, δε, στη συγγένεια χημικών ομάδων της βιοενεργής υάλου τόσο με τη χιτοζάνη, όσο και με τη χιτίνη. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρυθμός αποδόμησης ικριωμάτων, μέσα σε διάλυμα SBF. Βρέθηκε ότι η αποδόμηση ξεκινά την 7η ημέρα και είναι ομαλή και για τις τρεις κατηγορίες. Επίσης, για τη διερεύνηση της κυτταρικής ανταπόκρισης στα σύνθετα αυτά ικριώματα, ακολούθησε η εμβάπτισή τους σε διάλυμα θρεπτικού μέσου κυτταροκαλλιεργειών και ο ενοφθαλμισμός 105 κυττάρων σε κάθε σύνθετο δείγμα. Σημειώθηκε αποπτωτική πορεία κυττάρων τόσο στα ικριώματα χιτίνης, όσο και σε αυτά της χιτοζάνης. Στην περίπτωση των ικριωμάτων χιτίνης, μάλιστα, η μείωση των κυττάρων και η αποπτωτική πορεία ήταν ραγδαίες. Στην περίπτωση των σύνθετων δειγμάτων με ικρίωμα χιτοζάνης παρατηρήθηκε το ίδιο φαινόμενο, αλλά σε πιο ήπια μορφή. Τέλος, μόνο στα ικριώματα χιτοζάνης- ζελατίνης καταγράφηκε αποπτωτική πορεία την πρώτη εβδομάδα, ενώ στη συνέχεια σημειώθηκε αύξηση και τελικά φαίνεται ότι σταθεροποιήθηκε ο αριθμός των κυττάρων. Παράλληλα, παρατηρήθηκε η αποδόμηση των ικριωμάτων μετά την παραμονή τους σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Είναι σημαντικό να επισημανθεί ότι η εικόνα αποδόμησης διαφοροποιείται από την παρουσία ή την απουσία κυττάρων. Το συμπέρασμα αυτό προκύπτει από τη συγκριτική μελέτη μικροφωτογραφιών SEM σύνθετων ικριωμάτων που παρέμειναν σε θρεπτικό μέσο με παρουσία ή όχι κυττάρων περιοδοντικού ιστού. Τα παραπάνω ευρήματα θα μπορούσαν να αποτελέσουν αρχή, ώστε να διερευνηθεί περεταίρω το σύνθετο υλικό με το ικρίωμα χιτοζάνης –ζελατίνης, ώστε τελικά να δημιουργηθούν in vivo μοντέλα με στόχο τη διερεύνηση της ανάπλασης περιοδοντικού ιστού, ειδικά στην περιοχή του ορίου των ακίνητων προσθετικών αποκαταστάσεων.