Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για τον προσδιορισμό κινολονών σε διάφορα δείγματα τροφίμων ζωϊκής προέλευσης και σε φαρμακευτικά σκευάσματα

Abstract

In the present work, different methods for the analysis of human and veterinary pharmaceutical formulations of quinolones and for the multi-residue determination of quinolones in various edible tissues and products of food-producing animals using HPLC, are developed. Ten quinolones are examined herein: enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine. The method has initially been developed for the separation of the examined quinolones in standard solution, using an HPLC system of Shimadzu with a gradient pump LC-9A and an SPD - M6A detector. The analytical column was a C18 PerfectSil®Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 μm), provided by MZ-Analysentechnik. The mobile phase was a mixture of Α: TFA 0.1%, B: CH3CN and C: CH3OH delivered to the system by a gradient program, at a constant flow rate of 1.3 mL/min. The chromatogram was monitored at 275 nm for ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR and SAR and at 255 nm for OXO, NAL and FLU. For the quantitative determination, caffeine was used as internal standard, at a concentration of 7.5 ng/μL. The separation was achieved within 33 min, with resolution factors greater than 1.1. During method validation, it has been proved that the method was quite reproducible concerning the retention times of quinolones and their peak areas. Regression analysis revealed correlation coefficients between 0.990 and 0.9997, proving the linearity of the method. LOD defined as 3.3σ/S, was 10 ng for ENO, OFL, NOR, CIP, SAR and FLU, 5 ng for DAN, ENR and NAL and 15 ng for OXO. RSD values from the repeatability study ranged between 0.1 and 4.1% and RSD values from the precision study ranged between 0.3 and 7.8%. The developed method was applied to the analysis of commercial pharmaceutical formulations for human and veterinary medicine. The accuracy of the method was proved to be satisfactory, with only exception the one noticed for ENR injectable solution, where a mean relative error of -25% was obtained. However, similar results were also found in our previous paper. The developed method was then applied to the simultaneous multi-residue determination of the examined quinolones (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL and FLU) in bovine, porcine and ovine muscle tissues. The isolation of the quinolones from the matrix was performed by solid-liquid extraction, using TFA 0.1% in CH3OH. The sample was further purified by SPE on Lichrolut RP-18 Merck cartridges. The chromatographic method was validated according to the European Decision 2002/657/EC.

Η διατριβή αυτή πραγματεύεται την ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό δέκα (φθορο)κινολονών σε υποστρώματα δειγμάτων τροφίμων ζωικής προέλευσης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αναγκαία και πλέον ιδιαίτερα ευρεία χρήση των κινολονών καθιστά επιτακτική την ανάγκη του ελέγχου των τροφίμων που προέρχονται από ζώα στα οποία έχει γίνει πιθανή χρήση των συγκεκριμένων αντιβιοτικών. Σκοπός είναι η προάσπιση της δημόσιας υγείας από την κατανάλωση τροφίμων ζωικής προέλευσης που πιθανόν περιέχουν ίχνη κινολονών, ώστε να περιοριστούν, καθώς οδηγούν στην αύξηση της μικροβιακής αντοχής, στα συγκεκριμένα σκευάσματα. Αρχικά δόθηκε έμφαση στην ανάπτυξη της μεθόδου και στην επικύρωσή της σε πρότυπα διαλύματα. Στη μέθοδο χρησιμοποιήθηκε η αναλυτική στήλη PerfectSil® Target, η οποία μελετήθηκε ως προς την καταλληλότητά της για τον προσδιορισμό γενικότερα των (φθορο)κινολονών, την επαναληψιμότητα στις μετρήσεις και την ανθεκτικότητα του υλικού πλήρωσης στο πλήθος των αναλύσεων, ακόμα και σε δύσκολα υποστρώματα. Την ανάπτυξη της μεθόδου στα πρότυπα διαλύματα ακολούθησε η εφαρμογή σε διαφορετικά υποστρώματα. Η μέθοδος εφαρμόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των φθοροκινολονών ENO, OFL, NOR, DAN, CIP, ENR, SAR και FLU και των κινολονών OXO και NAL σε δείγματα μυϊκών ιστών πουλερικών, χοίρου, βοοειδών και προβάτου, σε δείγματα ήπατος βοοειδών και νεφρών χοίρων. Επίσης οι παραπάνω κινολόνες μελετήθηκαν στον κρόκο αυγού και σε διάφορες κατηγορίες γάλακτος (υψηλής και κανονικής παστερίωσης, υψηλών και χαμηλών λιπαρών). Για όλα τα παραπάνω υποστρώματα αναπτύχθηκαν οι κατάλληλες τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων, ώστε σε κάθε περίπτωση να εξασφαλίζεται η μέγιστη ανάκτηση των εξεταζόμενων κινολονών. Τα δείγματα που μελετήθηκαν εμβολιάστηκαν στο εργαστήριο με γνωστές συγκεντρώσεις των προσδιοριζόμενων κινολονών, ενώ στη συνέχεια έγινε εφαρμογή σε διάφορα δείγματα του εμπορίου. Στόχος ήταν οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν να προσφέρουν αξιόπιστα και επαναλήψιμα αποτελέσματα, ώστε να εξασφαλίζεται η ασφαλής χρήση τους για τον έλεγχο των τροφίμων ζωικής προέλευσης, σύμφωνα πάντα με τις διατάξεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης.