Μοριακή μελέτη για το χαρακτηρισμό των ελληνικών στελεχών των ιών της προϊούσας πνευμονίας/εγκεφαλίτιδας του προβάτου και της αρθρίτιδας/εγκεφαλίτιδας της αίγας

Abstract

The objective of this work was to develop a new molecular method for the polyvalent detection of SRLVs and to obtain sequence information in a conserved region of Greek SRLV (GrSRLV) isolates genome. These can serve to perform phylogenetic analysis and be taken as representative strains of those circulating among sheep and goats in Greece. Thereby, the new sequence information of GrSRLV, could be used to perform molecular analysis and epidemiological studies. The present study was performed in two parts. In the first, a polyvalent and sensitive semi-nested PCR assay for reliable detection of SRLV proviral DNA; using degenerate deoxyinosine-substituted primers was developed. Its results were then compared with those of agar gel immunodiffusion (AGID) test and evaluated using different virus isolates and template preparation methods. A total of 220 sheep and goats, 2 to 4 years of age, were used. Of these, 76 representing group I (57 sheep and 19 goats) were used for obtaining SRLV isolates for evaluating the polyvalency of the semi-nested PCR protocol. They originated from eight mixed flocks from central and northern Greece, with a history of SRLV infection and showing respiratory signs. The other 144 animals (75 sheep and 69 goats), representing group II were used for the comparison of the semi-nested PCR with the AGID serological test results. These were coming from one mixed flock from Grevena region in northwestern Greece, in which only goats exhibited clinical respiratory symptoms, mastitis and arthritis at the time of analysis. Twenty isolates representing different SRLV subtypes were used as standards for evaluating the detection polyvalence of the semi-nested PCR. These were subtypes A3, A4, A5, B1 (two isolates) and B2 originating from Switzerland, six field isolates from The Netherlands, five Greek isolates and the Icelandic K1514 Maedi-Visna virus, British EV1 and CAEV-Cork reference strains. In addition, two non-SRLV retrovirus samples, HTLV (Human T-cell Lymphotropic virus) and EIAV (Equine Infectious Anaemia Virus), were used to assess the specificity of the PCR reaction. Different template preparation methods included. DNA extracts from infected cell cultures (11 samples), separated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (76 samples), and whole blood (144 samples) were used.

Η προϊούσα πνευμονία/εγκεφαλίτιδα του προβάτου και η αρθρίτιδα/ εγκεφαλίτιδα της αίγας, είναι ιογενή νοσήματα της κατηγορίας των «βραδέων επίμονων ιογενών λοιμώξεων». Τα νοσήματα αυτά είναι γνωστά στην Ελλάδα από παλιά και θεωρούνται ως αίτια σημαντικών οικονομικών απωλειών, κυρίως στην προβατοτροφία. Οφείλονται σε δύο ιούς του γένους Lentivirus (οικογένεια Retroviridae), οι οποίοι τα τελευταία χρόνια μετονομάστηκαν σε lenti-ιούς των μικρών μηρυκαστικών (Small Ruminant Lentiviruses, SRLVs), διότι είναι γενετικά συγγενείς και συνιστούν έναν σύνθετο ετερογενή πληθυσμό ιικών σωματιδίων. Η πρόληψη των παραπάνω νοσημάτων στηρίζεται στην ανεύρεση των μολυσμένων ζώων με τη βοήθεια ορολογικών δοκιμών και στην εν συνεχεία απομάκρυνσή τους από το ποίμνιο. Το πρόβλημα με τις ορολογικές δοκιμές είναι ότι δεν μπορούν να ανιχνεύσουν αξιόπιστα το σύνολο των μολυσμένων αιγοπροβάτων. Για να δοθεί λύση, έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί διάφορα πρωτόκολλα PCR , των οποίων όμως η ευαισθησία και το εύρος ανίχνευσης εμφανίζουν μεγάλες διακυμάνσεις,, διότι επηρεάζονται από την μεγάλη παραλλακτικότητα που παρατηρείται στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων μεταξύ των διαφόρων στελεχών/απομονώσεων των SRLVs, καθώς και από τη μείωση του ιικού φορτίου στον μολυσμένο οργανισμό, που παρατηρείται μετά την παραγωγή των αντισωμάτων. Κατόπιν αυτών, αρκετοί ερευνητές προτείνουν τη συνδυασμένη χρήση ορολογικών μεθόδων και τεχνικών PCR για έγκαιρη και σωστή διάγνωση των λοιμώξεων από SRLVs. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν να αναπτυχθεί μια μοριακή δοκιμή ανίχνευσης (ημι-ένθετη PCR) γενικής ειδικότητας και μεγάλης ευαισθησίας για τα διαφορετικά στελέχη των lenti-ιών των μικρών μηρυκαστικών. Η δοκιμή PCR και οι διάφορες μέθοδοι προετοιμασίας του εκμαγείου, αξιολογήθηκαν ως προς το εύρος, την ειδικότητα και την ευαισθησία ανίχνευσης χρησιμοποιώντας μεγάλο αριθμό στελεχών και απομονώσεων από το εξωτερικό και την Ελλάδα, καθώς και την ορολογική μέθοδο AGID, ως μέτρο σύγκρισης. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η φυλογενετική σχέση ελληνικών απομονώσεων των SRLVs, με βάση το προϊόν (404 ζβ) της ημι-ένθετης PCR, που αφορούσε τμήμα του γονιδίου pol το οποίο κωδικοποιεί μέρος των πρωτεϊνών dUTPάση και ενσωματάση.