Τροποποίηση των υποστρωμάτων της in vitro παραγωγής εμβρύων βοοειδών με τη χρήση γουαϊαζουλενίου και μελατονίνης

Abstract

Media synthesis for bovine in vitro embryo production (IVP), mimics the in vivo composition of fluids where oocytes mature (follicular fluid, FF), are fertilized and early embryonic development occurs (FF and oviductal fluid, OF). Given that oxidative stress adversely affects the IVP outcome, in this study we assessed the antioxidant capacity (AC) of the bovine FF and OF as well as that of the IVP media. We adjusted the in vitro to the in vivo conditions by using the antioxidants guaiazulene (G) and melatonin (M) and evaluated the effect of this adjustment on the IVP efficiency. The circadian manner of the in vivo M secretion was also taken into consideration. FF and OF samples were collected from 10 Holstein cows in oestrus. Media samples from all the IVP phases, namely in vitro oocyte maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and in vitro embryo culture (IVC) as well as samples coming from serially diluted samples of the antioxidants in IVP media were also used in order to choose the properly modified media, that provide total protection against lipid peroxidation (TPaLP) similar to that of their biological reference. We assessed AC according to the sample ability to inhibit rat hepatic membrane lipid peroxidation. TPaLP was assayed spectrophotometrically by determination of the 2-Thiobarbituric acid reactive material. For our experiments 8,655 oocytes were used. The following experimental design was used: Microscopical evaluation of nuclear maturation of fixed and stained (2% orcein) oocytes after 18h IVM in the presence of G or after 18h and 24h IVM in the presence of M. Stereomicroscopical evaluation of cleavage and/or early embryo development (>4-cell embryos) after IVP in the presence of G or M during part, each one or combinations of IVP phases. Our results indicate that: Bovine FF and OF around oestrus provide significantly higher TPaLP than that of their respective IVP media. When added to the IVM medium, G increased the proportion of matured oocytes. G improved cleavage and embryo development rates when present during IVM and/or 48h IVC. M increased cleavage and embryo development rates, when present only in the last 8h of 24h IVM. M improved embryo development when added to the IVM medium only for the first 8 of 24h IVM, or for the last 6h of 18h IVM, or for the last 8h of 48 IVC. In conclusion, G and M supplementation of the IVP media, at concentrations simulating AC of their biological reference, may improve the bovine IVP efficiency.

Στην παρασκευή των υποστρωμάτων της in vitro παραγωγής εμβρύωνς (IVP) επιδιώκεται η απομίμηση του αντίστοιχου in vivo περιβάλλοντος, δηλ. του υγρού του προωοθυλακιορρηκτικού ωοθυλακίου (Υ.Π.Ω.) ή /και του υγρού του ωαγωγού περί τον οίστρο (Υ.Ω.). Η IVP επηρεάζεται αρνητικά από το οξειδωτικό στρες. Στην εργασία αυτή, αφού προσομοιώθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα (Α.Ι.) του Υ.Π.Ω. και του Υ.Ω. στα αντίστοιχα υποστρώματα της IVP με τη χρήση των αντιοξειδωτικών γουαϊαζουλενίου (Γ) και μελατονίνης (Μ), εξετάσθηκε η επίδραση της προσομοίωσης αυτής στις αποδόσεις της IVP. Επίσης, επιχειρήθηκε η προσομοίωση του κιρκάδιου ρυθμού έκκρισης της Μ στις in vitro συνθήκες. Συλλέχθηκαν δείγματα Υ.Π.Ω. και Υ.Ω. από 10 αγελάδες σε οίστρο καθώς και από τα κλασικά υποστρώματα της IVP, δηλ. της in vitro ωρίμανσης ωαρίων (IVM), της in vitro γονιμοποίησης (IVF) και της in vitro καλλιέργειας εμβρύων (IVC). Δείγματα λήφθηκαν από τροποποιημένα υποστρώματα με Α.Ι. ανάλογη των αντίστοιχων βιολογικών υγρών. Η Α.Ι. προσδιορίστηκε με βάση την ικανότητα να αναστείλουν την προκαλούμενη λιπιδική υπεροξείδωση (Λ.Υ.) μεμβρανών ήπατος επιμύων. Η Λ.Υ. υπολογίστηκε φασματοφωτομετρικά με προσδιορισμό του αντιδρώντος με 2-θειοβαρβιτουρικό οξύ προϊόντος. Ακολούθησε η επιλογή 8.655 ωαρίων ύστερα από αναρροφήσεις ωοθυλακίων από πτωματικές ωοθήκες αγελάδων. Έγιναν οι πειραματισμοί: IVM για 18 ώρες με προσθήκη Γ ή για 18 και 24 ώρες με προσθήκη Μ, μονιμοποίηση, χρώση (ορκεΐνη 2%) και μικροσκοπική εκτίμηση της ωρίμανσης του πυρήνα. IVP με ή χωρίς την προσθήκη Γ ή Μ στα επιμέρους στάδια. Η εκτίμηση της επίδρασης στη γονιμοποίηση ή/και στην εμβρυική εξέλιξη γινόταν με στερεοσκοπική παρατήρηση μετά από 48ωρη IVC. Διαπιστώθηκε ότι: Το Υ.Π.Ω. και το Υ.Ω. βοοειδών σε οίστρο έχουν σημαντικά ισχυρότερη Α.Ι. από τα αντίστοιχα υποστρώματα της IVP. Η προσθήκη Γ στην IVM αύξησε το ποσοστό ώριμων ωαρίων, ενώ η προσθήκη του στην IVM ή/και στην IVC βελτίωσε τα ποσοστά γονιμοποίησης ή/και ανεπτυγμένων (>4 κύτταρα) εμβρύων. Η Μ οδήγησε σε σημαντικά μεγαλύτερα ποσοστά γονιμοποίησης, όταν προστέθηκε στο τελευταίο τρίτο 24ωρης IVM και σε μεγαλύτερο ποσοστό ανεπτυγμένων εμβρύων, όταν προστέθηκε στο πρώτο ή το τελευταίο τρίτο 24ωρης IVM, στο τελευταίο τρίτο 18ωρης IVM, καθώς και στις τελευταίες 8 ώρες 48ωρης IVC. Συμπερασματικά, η προσθήκη των αντιοξειδωτικών Γ και Μ στα υποστρώματα της IVP σε συγκεντρώσεις που προσομοιώνουν την Α.Ι. των in vivo στις in vitro συνθήκες, μπορεί να βελτιώσει τις αποδόσεις της IVP βοοειδών.