ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΒΛΑΣΤΗΜΕΝΑ ΣΠΕΡΜΑΤΑ ΚΡΙΘΗΣ - ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΜΙΑΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΔΙΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΖΙΤΩΝ

Abstract

ΔΙΕΡΕΥΗΘΗΚΕ Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΒΛΑΣΤΗΜΕΝΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΩΝ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΚΑΙ ΙΔΙΑΙΤΕΡΑ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΕ ΜΙΑ ΘΕΡΜΟΑΝΤΟΧΗ ΑΥΤΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ, Η ΟΠΟΙΑ ΕΙΝΑΙ ΑΝΕΞΑΡΤΗΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΔΙΣΘΕΝΩΝ ΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΚΑΙ Η ΟΠΟΙΑ ΑΠΟΔΕΙΧΘΗΚΕ ΟΤΙ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΕ ΜΙΑ ΚΙΝΑΣΗ ΔΙΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΖΙΤΩΝ (NDP-ΚΙΝΑΣΗ). Η NDP-ΚΙΝΑΣΗ ΑΠΟΜΩΝΩΘΗΚΕ ΣΕ ΚΑΘΑΡΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ ΟΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ. Ο ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΕΠΙΤΕΥΧΘΗΚΕ ΜΕ ΤΑ ΑΚΟΛΟΥΘΑ ΣΤΑΔΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ:(Α) ΙΟΝΙΚΗΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ (DEAE-ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ), (Β) ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ (SEPHADEX G-100) ΚΑΙ (Γ) ΑΓΧΙΣΤΕΙΑΣ (ΑΤΡ-ΑΓΑΡΟΖΗ). Η ΝDP-ΚΙΝΑΣΗ ΕΧΕΙ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ ΠΕΡΙΠΟΥ 70 KDA ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΕΝΑΟΜΟΜΕΡΕΣ ΕΝΖΥΜΟ ΤΕΣΣΑΡΩΝ ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΜΟΤΙΑΚΟΥ ΒΑΡΟΥΣ 16,5 KDA ΕΧΕΙΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ ΣΕ PH 4,95 ΚΑΙ ΕΙΝΑΙ ΙΔΙΑΙΤΕΡΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟ ΣΤΗ ΘΕΡΜΑΝΣΗ. ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΒΕΛΤΙΣΤΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΕ ΜΙΑ ΕΥΡΕΙΑ ΠΕΡΙΟΧΗ PH:6,5,-8,5.Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΔΙΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΖΙΤΩΝ ΑΠΑΙΤΕΙ ΤΗΝ ΥΠΑΡΞΗ ΔΙΣΘΕΝΟΥΣ ΜΕΤΑΛΛΙΚΟΥ ΙΟΝΤΟΣ, ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΜG ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ Μ CA^++, MN^++ Η ΝI^++. AΠΟΥΣΙΑ ΜΕΤΑΛΛΟΥ, Η ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΡΟΧΩΡΕΙ ΜΟΝΟ ΜΕΧΡΙ ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΣΤΑΔΙΟ, ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ Ο ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΝΔΙΑΜΕΣΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΜΟΡΦΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ PING-PONG. ΚΑΘΕ ΜΙΑ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ ΕΧΕΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΚΑΙ Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΓΙΝΕΤΑΙ ΣΤΟ ΑΜΙΝΟΞΥ ΙΣΤΙΔΙΝΗ. Η KM ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΩΣ ΠΡΟΣ ΑΤΡ ΚΑΙ TDP ΕΙΝΑΙ 0,8 MM ΚΑΙ 2,5 MM ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ. ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΣΕ ΜΙΚΡΟ ΠΟΣΟΣΤΟ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΚΑΙ ΣΤΟ ΑΜΙΝΟΞΥ ΣΕΡΙΝΗ. ΑΚΟΜΗ ΒΡΕΘΗΚΕ ΟΤΙ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΕΙ ΣΕ ΜΙΚΡΗ ΕΚΤΑΣΗ ΤΗΝ ΙΣΤΟΝΗ Η1 ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΑΖΕΙΝΗ. (ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ).

THE PROTEIN - PHOSPHOZYLATING ACTIVITY OF AN EXTZACT OF GERMINATING BARLEY SEEDS WAS INNVESTIGATED. MORE SPECIFICALLY A THERMOSTABLE, METAL - INDEPENDENT AUTOPHOSPHOZYLATION ACTIVITY WAS ISOLATED AND STUDIED. THE ACTIVITY WAS SHOWN TOBE DUE TO A NDP-KINASE THAT CATALYZES THE TRAUSFER OF THE Γ-PHOSPHOZYL GROUP OF A NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE TO A NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE THROUGHT A PHOSPHOZYLATED ENZYME INTERMEDIATE. THE PURIFICATION WAS ACHIEVED BY MEANS OF THE FOLLWING SERIES OF COLUMN CHROMATOGRAPHY STEPS: (A) ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY ON DEAE- CELLULOSE,(Β) GEL FILTATION ON SEPHADEX G-100 AND (C) AFFINITY CHROMATOGRAPHY ON ATP-AGAROSE. THE NATIVE NDP-KINASE HAS A MOLECULAR WEIGHT OF 70 KDA.IT IS COMPOSED OF FOUR SUBUNITS EACH WITH ON APPARENT MOLECULAR MASS OF 16,5 KDA. ITS ISOELECTRIC POINT IS AT PH 4,95, IT IS HEAT-REZISTANT AND ACTS OPTIMALLY OVER A BROAD PH RANGE OF BETWEEN 6.5 AND 8,5 PHOSPHRYLTION OF THE NUCLEOSIDE DIPHO SPHATES REGUIRS THE PRESENCE OF DIVALENT METAL IONS, SUCH AS MG^++, CA^++, MN^++ OR NI^++, IN THE PRESENCE OF EDTA THE REACTION PROCEEDS ONLY UP TOTHE FIRST STAGE, THAT IS THE FORMATION OF THE PHOSPHORYLATED ENZYME INTERMEDIATE, ACCORDING TO A PING-PONG MECHANISM. EVERY SUBUNIT POSSESSES ENZYME ACTIVITY AND IT IS AUTOPHOSPHOZYLATED AT AN HISTIDINE RESIDUE KM FOR ATP AND TDP IS 0.8 MM AND 2,5 MM RESPECTIVELY. THE ENZYME IS AUTOPHOSPHOZYLATED TO A LIMIDED EXTENT AT SERINE,RESIDUE, WHILE IT IS CARABLE OF PHOSPHORYLATING THE H1 HISTONE AND CASEIN ALSO TO A LIMITED EXTEN. THE LEVEL OF NDP-KINASE WERE STUDIED DURING SEED GERMI NATION,(ABSTRACT TRUNCATED).