Μοριακός έλεγχος RAS μεταλλάξεων του καρκίνου παγκρέατος στο πλάσμα ασθενών με ανεγχείρητο παγκρεατικό καρκίνο με υγρή βιοψία και μελέτη RAS μεταλλάξεων, τροποποιητών RAS σηματοδότησης, ρύθμισης εξωκύττωσης νουκλεϊκών οξέων στον πρωτοπαθή όγκο και της κλωνικής αιμοποίησης: μια προοπτική μελέτη παρατήρησης

Abstract

Introduction: Pancreatic ductal adenocarcinoma is a fatal disease with a poor prognosis, with an increasing incidence every year worldwide. 5-year overall survival remains lower than 10%. Despite new emerging therapies for locally advanced and metastatic PDAC (NALIRIFOX, FOLFIRINOX, Abraxane/Gemcitabine), reliable prognostic and predictive biomarkers with established clinical utility are lacking. Recent advancements in the effectiveness of current chemotherapy combinations have led to objective response rates of 20-30% in metastatic disease and an estimated median survival of 8-12 months. In locally advanced and metastatic PDAC, a reliable biomarker with prognostic or early predictive value would allow the de-escalation or intensification of treatment according to its efficacy and enable early therapy modifications if deemed ineffective. Since pancreatic cancer harbors KRAS exon 2 or exon 3 mutations (codons 12, 13, 61) in 90% of cases, KRAS mutation in circulating tumor DNA, the detection of KRAS mutations with liquid biopsy may indicate disease burden, prognosis, and treatment response. Furthermore, the agreement or lack thereof regarding the presence of RAS mutation in the tissue (primary pancreatic cancer) is of exceptional interest. Aim: In light of the above, the primary objective of this study is to detect mutational burden in patients with unresectable and metastatic pancreatic cancer and determine whether the change before and after chemotherapy can serve as an early prognostic biomarker of treatment response. Additionally, the study aims to assess the utility of sequential liquid biopsies and standard tissue analysis to customize therapeutic strategy, potentially offering predictive value for therapeutic decision-making. Methods: Plasma samples from patients with unresectable and metastatic ductal adenocarcinoma of the pancreas were collected before the initiation of chemotherapy and 4-6 weeks later, from the University Hospital of Ioannina, the General Oncology Hospital of Kifisia “Agii Anargyroi,” and the General Hospital of Patras “Agios Andreas.” Clinical data were extracted from patients’ medical records. Analysis was conducted for 34 mutations in the KRAS and NRAS genes (codons 12, 13, 59, 61, 117, 146) using BEAMing Digital PCR, a high-sensitivity technique enabling quantification of mutant alleles in plasma (Mutant Allele Fraction, MAF). Corresponding tissue mutations were analyzed using allele-specific RT-PCR on the Roche Cobas platform. Mutation analysis was also carried out using the NGS method. Mutations were detected with NGS in a subset of 28 patients. Through NGS, the following gene mutations were examined: KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, ERBB2, PIK3CA, MAD4, TP53, APC, and AKT1.Results: The presence of KRAS mutations in pre-treatment samples was estimated at 77%. The most frequently detected KRAS mutations via liquid biopsy were KRAS G12D and KRAS G12V, alongside mutations in TP53 and NRAS. Comparison between KRAS mutations in tissue, the standard method for molecular testing, and plasma revealed a positive percent agreement (PPA) of 87%, a negative percent agreement (NPA) of 50%, and an overall percent agreement (OPA) of 85%. There was an 82% change in mutation burden between the pre-treatment sample and the sample taken 4-6 weeks after treatment in the overall population. The proportion of patients without KRAS mutations increased from 39% in the initial pre-treatment sample to 61% in the post-treatment sample, indicating treatment response. The median progression-free survival (mPFS) was prolonged (11 months) for patients with stable mutational burden versus 9.8 months for those with a reduced mutational load. A statistically significant difference was found in survival between patients with stable mutational status and those with varying mutational burden. There was also a statistically significant association between changes in mutational burden (reduction or increase) and imaging response and progression, respectively. There was concordance between mutational burden changes (increase-decrease) and corresponding variations in serum biomarkers CA 19-9 and CEA. Conclusions: The results of the present study support the initial hypothesis that the detection of RAS mutations plays a significant prognostic role in patients with unresectable and metastatic PDAC. Specifically, their change (either decrease or increase) before and after the administration of chemotherapy is directly linked to the clinical and imaging response of the patients. Consequently, using liquid biopsy to detect RAS mutations can play a significant role, both prognostic and predictive, in monitoring the progress of patients with unresectable and metastatic pancreatic adenocarcinoma. However, additional results from randomized clinical trials are required to establish liquid biopsy as a procedure for use in everyday clinical practice. This study adequately supports for the rationale for further clinical trials to be conducted.

Εισαγωγή: Το πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος είναι μια νόσος που σχετίζεται με πτωχή πρόγνωση, και η επίπτωσή του φαίνεται να έχει αυξητική τάση κάθε χρόνο παγκοσμίως. Η πενταετής ολική επιβίωση (overall survival, OS), παραμένει μικρότερη του 10%. Παρά την ανάδυση νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση του ανεγχείρητου και μεταστατικού παγκρεατικού καρκίνου (NALIRIFOX, FOLFIRINOX, Gemcitabine/Nab-Paclitaxel), απουσιάζουν αξιόπιστοι προγνωστικοί και προβλεπτικοί βιοδείκτες με τεκμηριωμένη κλινική χρησιμότητα. Πρόσφατες πρόοδοι στην αποτελεσματικότητα των υπαρχόντων συνδυαστικών σχημάτων συστηματικής θεραπείας οδήγησαν σε ποσοστά αντικειμενικής ανταπόκρισης της τάξης του 20-30% στη μεταστατική νόσο, και σε χρόνους διάμεσης επιβίωσης μεταξύ 8-12 μηνών. Στον ανεγχείρητο και μεταστατικό παγκρεατικό καρκίνο, ένας αξιόπιστος δείκτης με προγνωστική ή πρώιμη προβλεπτική ικανότητα θα επέτρεπε την προσαρμογή της θεραπείας σε χαμηλής τοξικότητας ανακουφιστική μονοθεραπεία έναντι πιο εντατικής συνδυαστικής θεραπείας, ενώ θα επέτρεπε και την έγκαιρη αλλαγή θεραπείας αν κρινόταν αναποτελεσματική. Καθώς ο παγκρεατικός καρκίνος φέρει μεταλλάξεις KRAS εξονίων 2 ή 3 (κωδικόνια 12, 13, 61) στο 90% των περιπτώσεων, η μετάλλαξη KRAS στο ελεύθερο DNA του όγκου που βρίσκεται στο πλάσμα μπορεί να αποτελέσει ένδειξη τόσο του φορτίου της νόσου, όσο και της πρόγνωσης και ανταπόκρισης στη θεραπεία. Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης η συμφωνία ή μη ύπαρξης RAS μετάλλαξης στον ιστό (πρωτοπαθής παγκρεατικός καρκίνος). Σκοπός: Σύμφωνα με τα παραπάνω, ένας από τους βασικούς στόχους αυτής της διατριβής είναι η ανίχνευση του φορτίου μεταλλάξεων σε ασθενείς με ανεγχείρητο ή μεταστατικό παγκρεατικό καρκίνο, και η διερεύνηση του εάν η μεταβολή του πριν και μετά τη χορήγηση χημειοθεραπείας, μπορεί να αποτελέσει πρώιμο προγνωστικό δείκτη ανταπόκρισης. Επιπλέον στοχεύει στην μελέτη της χρησιμότητας των διαδοχικών υγρών βιοψιών, παράλληλα με τον έλεγχο του ιστού, για την εξατομίκευση της θεραπευτικής στρατηγικής με πιθανή προβλεπτική αξία για την λήψη θεραπευτικής απόφασης. Μέθοδοι: Δείγματα πλάσματος ασθενών με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό πορογενές αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος πριν την έναρξη της χημειοθεραπείας και 4-6 εβδομάδες αργότερα, από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ιωαννίνων, από το Γενικό Ογκολογικό Νοσοκομείο Κηφισιάς “Οι Άγιοι Ανάργυροι” και από το Γενικό Νοσοκομείο Πατρών “Ο Άγιος Ανδρέας”. Συλλέχθηκαν κλινικά δεδομένα από τον ιατρικό φάκελο των ασθενών. Ελέγχθησαν για 34 μεταλλάξεις στα γονίδια KRAS και NRAS (κωδικόνια 12, 13, 59, 61, 117, 146) με ΒEAMing Digital PCR, η οποία αποτελεί τεχνική υψηλή ευαισθησίας που δίνει τη δυνατότητα ποσοτικοποίησης των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων στο πλάσμα (Μutant Αllele Fraction, MAF). Ο προσδιορισμός των αντίστοιχων μεταλλάξεων στον ιστό πραγματοποιήθηκε με allele-specific RT-PCR χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Cobas της Roche. Έγινε επίσης έλεγχος μεταλλάξεων με τη μέθοδο NGS. Η ανίχνευση των μεταλλάξεων με την μέθοδο NGS, πραγματοποιήθηκε σε ένα δείγμα 28 ασθενών. Με τη μέθοδο του NGS μελετήθηκαν οι εξής γονιδιακές μεταλλαγές: KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, ERBB2, PIK3CA, MAD4, TP53, APC, AKT1. Αποτελέσματα: Η ύπαρξη μεταλλάξεων KRAS στο δείγμα πριν την έναρξη θεραπείας υπολογίστηκε σε ποσοστό 77%. Οι συχνότερες μεταλλάξεις KRAS που ανιχνεύθηκαν με την υγρή βιοψία ήταν οι KRAS G12D και KRAS G12V και από τις υπόλοιπες ήταν οι μεταλλάξεις στο TP53, και στο NRAS. Η σύγκριση μεταξύ KRAS μεταλλάξεων στον ιστό, που αποτελεί την μέθοδο εκλογής για τον μοριακό έλεγχο, και στο πλάσμα έδειξε θετική ποσοστιαία συμφωνία (PPA) 87%, αρνητική ποσοστιαία συμφωνία (NPA) 50% και συνολική ποσοστιαία συμφωνία (OPA) 85%. Υπήρξε μεταβολή του φορτίου μεταλλάξεων μεταξύ του δείγματος πριν την έναρξη θεραπείας και του δείγματος 4-6 εβδομάδες μετά τη θεραπεία κατά 82%, στο σύνολο του πληθυσμού. Ο πληθυσμός των ασθενών χωρίς μετάλλαξη KRAS αυξήθηκε από 39% στο αρχικό δείγμα πριν την έναρξη θεραπείας σε 61% στο δείγμα 4-6 εβδομάδες μετά την έναρξη θεραπείας, λόγω εξάλειψης των KRAS μεταλλάξεων, ως ένδειξη ανταπόκρισης στην θεραπεία. Το διάμεσο διάστημα ελεύθερο προόδου νόσου (mPFS), ήταν μεγαλύτερο στην ομάδα των ασθενών με σταθερότητα στο φορτίο μεταλλάξεων (11 μήνες) έναντι 9,8 μηνών για τους ασθενείς με μείωση του φορτίου. Σε όρους ολικής επιβίωσης, υπολογίστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ασθενών με σταθερό και μεταβαλλόμενο φορτίο μεταλλάξεων. Υπολογίστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην συσχέτιση της μεταβολής του φορτίου μεταλλάξεων (μείωση ή αύξηση) με την απεικονιστική ανταπόκριση και την απεικονιστική επιδείνωση αντίστοιχα. Υπήρξε συμφωνία μεταξύ της μεταβολής του φορτίου μεταλλάξεων (αύξηση - μείωση), και της αντίστοιχης μεταβολής των καρκινικών δεικτών CA 19-9 και CEA Συμπεράσματα: Συνολικά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την αρχική υπόθεση, ότι η ανίχνευση των μεταλλάξεων του RAS, κατέχει σημαντικό προγνωστικό ρόλο στην πορεία των ασθενών με ανεγχείρητο ή μεταστατικό καρκίνο παγκρέατος, καθώς η μεταβολή τους (μείωση ή αύξηση) πριν και μετά την χορήγηση χημειοθεραπείας σχετίζεται με αντίστοιχη κλινική και απεικονιστική ανταπόκριση. Οπότε η χρήση της υγρής βιοψίας για ανίχνευση μεταλλάξεων ΚRAS και άλλων, μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο, προγνωστικό αλλά και προβλεπτικό για στην πορεία των ασθενών με ανεγχείρητο ή μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων και για την καθιέρωση της υγρής βιοψίας στην καθημερινή κλινική πρακτική, απαιτούνται τα αποτελέσματα τυχαιοποιημένων κλινικών δοκιμών. Η παρούσα μελέτη ενισχύει την υπόθεση για τον σχεδιασμό ανάλογων κλινικών δοκιμών.