Production of antioxidants from marine microalgae

Abstract

Microalgae have been extensively studied by biologists for at least 80 years, while during the last decades they attracted the interest of biotechnologists due to their high growth rate and attractive biochemical composition, which, depending on the species and cultivation conditions, can be suitable for the production of fuel, food or feed, or medicinal and cosmetic products. While initially biofuel was the main focus of microalgal research, recently interest in that sector has been diminished, with food, feed and pharmaceutical or cosmetic applications taking its place. One category of molecules that was only reported during the last 20 years in microalgae is phenolic compounds. Measured both with quantitative and qualitative techniques, this class of molecules has the potential to make microalgal biorefinery more feasible, introducing one additional high-value product next to pigments and omega-3 fatty acids (FAs). The goal of this thesis was to study the production of phenolics and other antioxidants from selected marine microalgae, while at the same time maintaining a high protein and omega-3 content, suitable for food or feed purposes. The selected marine species were Chlorella minutissima, Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana and Tisochrysis lutea, which had an attractive phenolic content as well as nutritious biomass composition according to the literature. The first step was to screen the proximate biomass composition and phenolic content of those species. To that end, cultivation under saturating light intensity and controlled temperature (25°C) was performed, while biomass was collected at two stages, the early and late stationary phases. C. minutissima and N. oculata displayed the highest growth rates, while all microalgae were rich in protein. Only N. oculata contained C20:5n3 (EPA) in significant amount, while only I. galbana, and T. lutea contained C22:6n3 (DHA). Biomass of all species was extracted sequentially with water (H2O) and methanol (MeOH) to assess its antioxidant content. While the methanolic extract of C. minutissima was the most potent in terms of the Folin-Ciocalteau (FC) assay, a quantitative method for the measurement of phenolics in plant samples, chromatographic analysis showed a complete absence of phenolics from all samples, with the exception of minor peaks in T. lutea extracts. The conclusion was that pigments such as chlorophyll might be significant interfering compounds in the FC assay, while the biomass composition of N. oculata and T. lutea held promise for the production of nutritious biomass and extracts of pigments and omega-3 FAs. To further explore the potential of antioxidant production from N. oculata and T. lutea different stressors were studied, specifically salinity, light intensity and the lack of aeration. A fractional factorial design with two levels was used, applying salinities of 38 and 60ppt (parts per thousand), and aeration of 2.4 or 0 volumes per volume per minute (vvm), while the levels of light intensity were different for the two species due to their different tolerances. Significant effects of lack of aeration were uncovered for N. oculata, with an increase of protein content and decrease of saturated FA content, while the apparent phenolic content according to the FC assay also increased without a correlation to pigments. On the contrary, T. lutea did not display positive effects under stress conditions, while its apparent phenolic content varied with pigment content. Conclusively, the lack of aeration might be a useful tool in the optimization of N. oculata cultivation, while further research is required on the compounds contributing to its apparent phenolic content. The next step was to optimize critical cultivation parameters, specifically temperature, pH, light period and illuminated surface to volume ratio, for the production of nutritious biomass and antioxidant extract from N. oculata. At the same time an extraction protocol was developed in collaboration with the Laboratory of Pharmacognosy and Chemistry of Natural Products (LPCNP), Department of Pharmacy, University of Patras. Like before, a fractional factorial approach was adopted, while two sets of experiments were performed, one in photobioreactors with online pH control via acid or base addition, and one in shake-flasks with daily adjustment of pH to a setpoint. Regression analysis to the combined data from the two experiments showed effects of temperature and light intensity that agree with the literature, for example the negative effects on these two parameters on EPA fraction in total lipids, while a more appealing biomass composition was attained in photobioreactors, which had a lower illuminated surface to volume ratio, at the expense of growth rate, which was higher in shake-flasks. Among the extraction methods that were assessed from LPCNP, ultrasound-assisted ethanolic extraction was chosen, due to the high protein content of the residual biomass, and the high pigment and EPA content of the extracts. The powdery texture and the practically zero moisture content of the residual biomass after freeze-drying were also very appealing for industrial use like incorporation to food products. Using the selected extraction method on the biomass from the optimization experiments showed an interesting effect of temperature, with a higher pigment content in extracts of biomass cultivated under high temperature despite the lower pigment biomass content. That could relate to a weakened cell wall or to a modified packing of pigments in the chloroplast and requires further examination. Co-optimizing the cultivation conditions for high protein and EPA biomass content as well as for high pigment extract content, showed that cultivation under 20-27.5°C, 16-18 hours of light and pH ~ 7.7 in photobioreactors would yield biomass with protein content of 40-60 % ash-free dry weight (AFDW) and EPA content of 3.2-4.5 % AFDW, while producing extract with at least 386 mg chlorophyll a (Chla) and 86 mg carotenoids L-1.Further investigation of the effects of cultivation conditions on the fatty acid content and profile on N. oculata was performed, using novel data from various cultivation systems and the available literature. A new regression method, the high dimensional selection with interactions algorithm, was equipped to assess a very large number of predictor parameters and their interactions, something that would not be possible with least squares regression. The findings confirmed well known effects such as those of temperature, while less studied effects such as that of potassium on palmitic acid were also confirmed, despite the absence of potassium-related studies in the training data. The most significant novel effect was that of aeration on EPA fraction in total lipids. Absence of aeration can modify the fatty acid content, decreasing saturated FAs while maintaining rather constant EPA content in biomass. More research is required to untangle the effects of aeration from that of mixing and clarify whether increase of oxygen under non-aerated conditions enhances fatty acid desaturation. Validation with external data showed a good performance of the models for total lipid content and EPA fraction in total lipids under stable conditions, while under outdoor conditions the EPA content was underestimated, with the overall trend being correctly predicted however. Adding more data to the training dataset should be a target for future improvement. Optimization showed great potential of N. oculata for EPA production, with up to ~ 11 % AFDW EPA in biomass and 0.12 g L-1 EPA achieved under optimal conditions, while the lack of aeration might be equipped to decrease the saturated FAs and achieve a more appealing dietary profile of the biomass. As a final step, the phenolic content of microalgal was revisited. Evaluating the literature on the phenolic content of microalgae according to both the Folin-Ciocalteau method and chromatographic analysis showed several issues with the reported findings and the methodology used. On the one hand, the interference of pigments, free-amino acids and nucleotides on the FC assay has been almost universally neglected, while antioxidant mechanisms of the cells such as the glutathione system have been studied to some extent but not in their effect to the FC assay. On the other hand, chromatographic evidence for phenolics in microalgae might be compromised by contamination from external sources via adsorption to the cell wall or absorption and biotransformation from the cells. The lack of two critical enzymes that initiate the phenylpropanoid pathway (PP) from most microalgae also makes the presence of cinnamic acids, anthocyanins and other products of PP enigmatic. Exclusion of phenolics from all growth media and accurately reported methods should be used in future research, while the removal of phenolics from waste streams by microalgae is very promising. In conclusion, N. oculata holds a great promise for the development of a biorefinery based on an ethanolic extract rich in pigments, EPA and possibly other antioxidants and a residual biomass with an excellent protein content and residual EPA, while the lack of aeration can be further explored as a finishing step for the improvement of the fatty acid profile and antioxidant content. Meanwhile, the phenolic content of microalgae might not be of great practical interest, considering the abundance of plant waste streams rich in phenolics, while the removal of phenolics by microalgae is promising, and the boosting effects of phenolics in microalgal metabolism is also an interesting research subject.

Τα μικροφύκη έχουν μελετηθεί εκτενώς από βιολόγους για τουλάχιστον 80 χρόνια, ενώ τις τελευταίες δεκαετίες προσέλκυσαν το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων λόγω του υψηλού ρυθμού ανάπτυξής τους και της ελκυστικής βιοχημικής τους σύστασης, η οποία, ανάλογα με το είδος και τις συνθήκες καλλιέργειας, μπορεί να είναι κατάλληλα για την παραγωγή καυσίμων , τροφίμων ή ζωοτροφών ή φαρμακευτικών και καλλυντικών προϊόντων. Ενώ αρχικά τα βιοκαύσιμα ήταν το κύριο επίκεντρο της έρευνας για τα μικροφύκη, πρόσφατα το ενδιαφέρον για αυτόν τον τομέα έχει μειωθεί, με τα τρόφιμα, τις ζωοτροφές και τις φαρμακευτικές ή καλλυντικές εφαρμογές να παίρνουν τη θέση του. Μια κατηγορία μορίων που έχει αναφερθεί σε μικροφύκη μόνο τα τελευταία 20 χρόνια είναι οι φαινολικές ενώσεις. Χαρακτηρισμένη τόσο με ποσοτικές όσο και με ποιοτικές τεχνικές, αυτή η κατηγορία μορίων έχει τη δυνατότητα να καταστήσει πιο εφικτό ένα βιοδιυλιστήριο μικροφυκών, εισάγοντας ένα επιπλέον προϊόν υψηλής αξίας μαζί με τις χρωστικές και τα ωμέγα-3 λιπαρά οξέα. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να μελετήσει την παραγωγή φαινολικών και άλλων αντιοξειδωτικών από επιλεγμένα θαλάσσια μικροφύκη, διατηρώντας ταυτόχρονα υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και ωμέγα-3, κατάλληλα για τρόφιμα ή ζωοτροφές. Τα επιλεγμένα θαλάσσια είδη ήταν τα Chlorella minutissima, Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana και Tisochrysis lutea, τα οποία είχαν ελκυστικό φαινολικό περι εχόμενο καθώς και θρεπτική σύνθεση βιομάζας σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Το πρώτο βήμα ήταν η εξέταση της σύνθεσης βιομάζας και της περιεκτικότητας σε φαινολικά συστατικά αυτών των ειδών. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια υπό συνθήκες κορεσμού σε φως και ελεγχόμενη θερμοκρασία (25°C), ενώ η βιομάζα συλλέχθηκε σε δύο στάδια, την πρώιμη και την όψιμη στατική φάση. Το C. minutissima και το N. oculata παρουσίασαν τους υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης, ενώ όλα τα μικροφύκη ήταν πλούσια σε πρωτεΐνη. Μόνο το N. oculata περιείχε C20:5n3 (EPA) σε σημαντική ποσότητα, ενώ μόνο το I. galbana και το T. lutea περιείχαν C22:6n3 (DHA). Η βιομάζα όλων των ειδών εκχυλίστηκε διαδοχικά με νερό και μεθανόλη για να εκτιμηθεί η περιεκτικότητά της σε αντιοξειδωτικά. Ενώ το μεθανολικό εκχύλισμα του C. minutissima ήταν το πιο ισχυρό όσον αφορά την μέθοδο Folin-Ciocalteau, μια ποσοτική μέθοδο για τη μέτρηση των φαινολικών σε φυτικά δείγματα, η χρωματογραφική ανάλυση έδειξε πλήρη απουσία φαινολικών από όλα τα δείγματα, με εξαίρεση μικρές κορυφές στα εκχυλίσματα T. lutea. Το συμπέρασμα ήταν ότι χρωστικές όπως η χλωροφύλλη μπορεί να έχουν σημαντική παρεμβολή στην μέθοδο FC, ενώ η σύνθεση βιομάζας των N. oculata καιT. lutea είναι υποσχόμενη για την παραγωγή θρεπτικής βιομάζας και εκχυλισμάτων χρωστικών και ωμέγα-3 FA.Για την περαιτέρω διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής αντιοξειδωτικών από N. oculata και T. lutea μελετήθηκαν διαφορετικοί στρεσογόνοι παράγοντες, συγκεκριμένα η αλατότητα, η ένταση του φωτός και η έλλειψη αερισμού. Χρησιμοποιήθηκε ένας κλασματικός παραγοντικός σχεδιασμός με δύο επίπεδα, με εφαρμογή αλατότητας 38 και 60 ppt και αερισμό 2.4 ή 0 vvm, ενώ τα επίπεδα έντασης φωτός ήταν διαφορετικά για τα δύο είδη λόγω των διαφορετικών ανοχών τους. Σημαντικές επιδράσεις της έλλειψης αερισμού αποκαλύφθηκαν για το N. oculata, με αύξηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη και μείωση της περιεκτικότητας σε κορεσμένα FA, ενώ η φαινομενική περιεκτικότητα σε φαινολικά σύμφωνα με την μέθοδο FC αυξήθηκε επίσης, χωρίς συσχέτιση με τις χρωστικές. Αντίθετα, το T. lutea δεν παρουσίασε θετικές επιδράσεις υπό συνθήκες στρες, ενώ η φαινομενική περιεκτικότητά του σε φαινολικά συστατικά ποικίλλει ανάλογα με την περιεκτικότητα σε χρωστική ουσία. Συμπερασματικά, η έλλειψη αερισμού μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη βελτιστοποίηση της καλλιέργειας του N. oculata, ενώ απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τις ενώσεις που συμβάλλουν στην αντιοξειδωτική του δράση. Το επόμενο βήμα ήταν να βελτιστοποιηθούν οι κρίσιμες παραμέτροι καλλιέργειας, συγκεκριμένα η θερμοκρασία, το pH, η περίοδος φωτός και η αναλογία φωτισμένης επιφάνειας προς όγκο, για την παραγωγή θρεπτικής βιομάζας και αντιοξειδωτικού εκ χυλίσματος από το N. oculata. Παράλληλα αναπτύχθηκε πρωτόκολλο εκχύλισης σε συνεργασία με το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων (LPCNP), Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. Όπως και πριν, υιοθετήθηκε μια κλασματική παραγοντική προσέγγιση, ενώ πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές πειραμάτων, μια σε φωτοβιοαντιδραστήρες με αυτόματο έλεγχο του pH μέσω προσθήκης οξέος ή βάσης και μία σε κωνικές φιάλες με καθημερινή ρύθμιση του pH σε μία προκαθορισμένη τιμή. Γραμμική παλινδρόμηση στα συνδυασμένα δεδομένα από τα δύο πειράματα έδειξε επιδράσεις θερμοκρασίας και έντασης φωτός που συμφωνούν με τη βιβλιογραφία, για παράδειγμα τις αρνητικές επιδράσεις των δύο αυτών παραμέτρων στο κλάσμα EPA στα συνολικά λιπίδια, ενώ μια πιο ελκυστική σύνθεση βιομάζας επιτεύχθηκε σε φωτοβιοαντιδραστήρες, οι οποίοι είχαν χαμηλότερη αναλογία φωτισμένης επιφάνειας προς όγκο, σε βάρος του υψηλότερου ρυθμού ανάπτυξης. Μεταξύ των μεθόδων εκχύλισης που αξιολογήθηκαν από το LPCNP, επιλέχθηκε η αιθανολική εκχύλιση με τη βοήθεια υπερήχων, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη της υπολειμματικής βιομάζας και της υψηλής περιεκτικότητας σε χρωστική και EPA των εκχυλισμάτων. Η υφή πούδρας και η πρακτικά μηδενική περιεκτικότητα σε υγρασία της υπολειμματικής βιομάζας μετά την λιοφιλίωση ήταν επίσης πολύ ελκυστικά χαρακτηριστικά για βιομηχανική χρήση, όπως η ενσωμάτωση σε προϊόντα διατροφής. Η χρήση της επιλεγμένης μεθόδου εκχύλισης στη βιομάζα από τα πειράματα βελτιστοποίησης έδειξε μια ενδιαφέρουσα επίδραση της θερμοκρασίας, με υψηλότερη περιεκτικότητα σε χρωστικές σε εκχυλίσματα βιομάζας που καλλιεργήθηκε σε υψηλή θερμοκρασία παρά την χαμηλότερη περιεκτικότητα αυτής της βιομάζας σε χρωστικές. Αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με ένα εξασθενημένο κυτταρικό τοίχωμα ή με μια τροποποιημένη συσσώρευση χρωστικών ουσιών στον χλωροπλάστη και απαιτεί περαιτέρω εξέταση. Η παράλληλη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας για υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και βιομάζα EPA καθώς και για υψηλή περιεκτικότητα σε εκχύλισμα χρωστικής, έδειξε ότι η καλλιέργεια σε θερμοκρασία 20-27.5°C, 16-18 ώρες φωτός και pH ~ 7.7 σε φωτοβιοαντιδραστήρες θα απέδιδε βιομάζα με περιεκτικύ τητα πρωτεΐνης 40-60% και EPA 3.2-4.5 % επί του ελεύθερου τέφρας ξηρού βάρους (AFDW), που παράγει εκχύλισμα με τουλάχιστον 386 mg Chla και 86 mg καροτενοειδή L-1.Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω διερεύνηση των επιδράσεων των συνθηκών καλλιέργειας στην περιεκτικότητα και το προφίλ σε λιπαρά οξέα στο N. oculata, χρησιμοποιώντας νέα δεδομένα από διάφορα συστήματα καλλιέργειας και τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Μια νέα μέθοδος παλινδρόμησης, ο αλγόριθμος επιλογής υψηλών διαστάσεων με αλληλεπιδράσεις, επιστρατεύτηκε για την αξιολόγηση ενός πολ ύ μεγάλου αριθμό παραμέτρων και των αλληλεπιδράσεων τους, κάτι που δεν θα ήταν δυνατό με κλασσική παλινδρόμηση ελαχίστων τετραγώνων. Τα ευρήματα επιβεβαίωσαν πολύ γνωστές επιδράσεις όπως αυτές της θερμοκρασίας, ενώ λιγότερο μελετημένες επιδράσεις όπως αυτή του καλίου στο παλμιτικό οξύ επιβεβαιώθηκαν επίσης, παρά την απουσία μελετών που σχετίζονται με το κάλιο στα δεδομένα εκπαίδευσης. Το πιο σημαντικό νέο αποτέλεσμα ήταν αυτό του αερισμού στο κλάσμα ΕΡΑ στα ολικά λιπίδια. Η απουσία αερισμού μπορεί να τροποποιήσει την περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα, μειώνοντας τα κορεσμένα FA ενώ διατηρείται σταθερή η περιεκτικότητα σε EPA στη βιομάζα. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να διαχωριστούν οι επιδράσεις του αερισμού από αυτές της ανάμειξης και να διευκρινιστεί εάν η αύξηση του οξυγόνου σε μη αεριζόμενες συνθήκες ενισχύει τον αποκορεσμό των λιπαρών οξέων. Η επικύρωση των μοντέλων με εξωτερικά δεδομένα έδειξε καλή απόδοση των μοντέλων για ολική περιεκτικότητα σε λιπίδια και κλάσμα EPA σε ολικά λιπίδια υπό σταθερές συνθήκες, ενώ σε υπαίθριες συνθήκες η περιεκτικότητα σε EPA υποεκτιμήθηκε, με τη συνολική τάση ωστόσο να έχει προβλεφθεί σωστά. Ο εμπλουτισμός του συνόλου δεδομένων εκπαίδευσης θα πρέπει να είναι στόχος για μελλοντική βελτίωση. Η βελτιστοποίηση έδειξε μια μεγάλη προοπτική του N. oculata για την παραγωγή EPA, με έως και ~ 11% AFDW EPA στην βιομάζα και 0.12 g L-1 EPA να επιτυγχάνεται υπό βέλτιστες συνθήκες, ενώ η έλλειψη αερισμού μπορεί να είναι εξοπλισμένη για τη μείωση των κορεσμένων FA και την επίτευξη πιο ελκυστικού διατροφικού προφίλ της βιομάζας. Ως τελικό βήμα, επανεξετάστηκε το φαινολικό περιεχόμενο των μικροφυκών. Η αξιολόγηση της βιβλιογραφίας σχετικά με την περιεκτικότητα σε φαινολικά μικροφύκια σύμφωνα με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau και τη χρωματογραφική ανάλυση έδειξε αρκετά προβλήματα με τα αναφερόμενα ευρήματα και τη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε. Από τη μία πλευρά, η παρεμβολή χρωστικών, ελεύθερων αμινοξέων και νουκλεοτιδίων στον προσδιορισμό FC έχει σχεδόν ολικά παραμεληθεί, ενώ οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί των κυττάρων όπως το σύστημα γλουταθειόνης έχουν μελετηθεί σε κάποιο βαθμό αλλά όχι και η επίδρασή τους στην μέθοδο FC. Από την άλλη πλευρά, οι χρωματογραφικές ενδείξεις για φαινολικές ουσίες στα μικροφύκη μπορεί να διακυβεύονται από μόλυνση από εξωτερικές πηγές μέσω προσρόφησης στο κυτταρικό τοίχωμα ή απορρόφησης και βιομετατροπής από τα κύτταρα. Η έλλειψη δύο κρίσιμων ενζύμων που εκκινούν το μονοπάτι του φαινυλοπροπανοειδούς (PP) από τα περισσότερα μικροφύκη καθιστά επίσης αινιγματική την παρουσία κινναμωμικών οξέων, ανθοκυανινών και άλλων προϊόντων του ΡΡ. Αποκλεισμός των φαινολικών από όλα τα μέσα ανάπτυξης και οι λεπτομερώς αναφερόμενες μέθοδοι θα πρέπει να εφαρμοστούν σε μελλοντικές έρευνες, ενώ η απομάκρυνση των φαινολικών από τα ρεύματα αποβλήτων από τα μικροφύκη είναι πολλά υποσχόμενη. Συμπερασματικά, το N. oculata είναι υποσχόμενο για την ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου βασισμένου σε αιθανολικό εκχύλισμα πλούσιο σε χρωστικές, EPA και πιθανώς άλλα αντιοξειδωτικά και υπολειμματική βιομάζα με εξαιρετική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη και υπολειπόμενο EPA, ενώ η έλλειψη αερισμού μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω ως τελικό βήμα για τη βελτίωση της περιεκτικότητας σε λιπαρά οξέα. Η περιεκτικότητα των μικροφυκών σε φαινολικά ίσως να μην παρουσιάζει πρακτικό ενδιαφέρον, λαμβάνοντας υπόψη την αφθονία των ροών φυτικών αποβλήτων πλούσιων σε φαινολικές ουσίες, παράλληλα όμως η απομάκρυνση φαινολικών από τα μικροφύκη είναι πολλά υποσχόμενη, ενώ η διέγερση των μικροφυκών από φαινολικά είναι επίσης ένα ενδιαφέρον ερευνητικό θέμα.