Μελέτη της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης και βιοκαταλυτικής συμπεριφοράς του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica

Abstract

The aim of the present work is the biotechnological exploitation and biocatalytic behavior of microalgae Nannochloropsis oceanica CCMP1779. The role of the initial culture pH, the photoperiod, the culture medium composition, the concentration of sodium bicarbonate (NaHCO3) and the concentration of sodium nitrate (NaNO3) and their combined effect were examined on biomass and lipid production as well as on the biosynthesis of chlorophyll and fatty acid’s profile. Biomass production and accumulation of lipids and chlorophyll were favored when N. oceanica CCMP1779 was cultured in culture medium at pH 8.0. During cultivation in continuous light, it was found that biomass production was higher and the maximum lipid content was observed when the photoperiod was set to 16:8 h light: dark. When the effect of medium composition of N. oceanica CCMP1779 was studied, it was found that the highest biomass concentration was achieved in presence of all the necessary constituents and vitamins of F/2 medium. The lipid content was found to be 10% higher when the culture was depleted in sodium nitrate. Of particular interest was the harvesting of Nannochloropsis oceanica using magnetic separation with naked iron oxide particles. The results showed that the highest separation efficiencies were achieved when the main phosphorus source from the culture medium was excluded. When N. oceanica CCMP1779 was cultured under increasing initial concentrations of bicarbonate (NaHCO3) and a constant initial nitrogen concentration, it was observed that quadrupling of the NaHCO3 concentration (from 0.5 g/L to 2.0 g/L) resulted in a 1.9-fold increase in biomass accumulation, while lipid content was found to be 32.2% w/w on dry biomass. Accordingly, it was found that increasing the initial concentration of NaNO3 (from 0 to 0.1125 g/L) resulted in an improvement of 54% of biomass production. However, the lipid content decreased from 41.6% to 31.2%, with the NaNO3 concentration increasing from 0 to 0.1125 g/L. Response surface methodology (RSM) was used to evaluate the combined effect of the initial carbon (NaHCO3) and nitrogen (NaNO3) source concentration on the synthesis of biomass, chlorophyll, lipid and fatty acid’s profile by Nannochloropsis oceanica CCMP1779, applying a 22 full-factorial central composite design with four axial points. Highest biomass production was obtained at high carbon concentration, while low nitrogen concentration favors the lipids accumulation (highest lipid content 44.65 %). The fatty acids (FAs) profile of N. oceanica CCMP1779 was dominated by saturated (SFAs) and monounsaturated fatty acids (MUFAs), comprising 88–95% of the total FAs, while polyunsaturated fatty acids (PUFAs) accounted for 5–11%% of the total FA’s. The optimal conditions for FAs accumulation and MUFAs content were: 1.3 g/L NaHCO3 and 0.06 g/L NaNO3 indicating that within the range of the variables used in this investigation, low nitrogen and moderate carbon concentrations favors the accumulation of FAs and MUFAs while the above mentioned conditions have the exact opposite effect on PUFAs and EPA content. Scale up cultivation of N. oceanica CCMP1779 in a 5L volume photobioreactor was attempted and dry biomass production of 1.47 g/L was achieved. Due to the abundance of biotechnological applications of enzyme catalysis, the experimental results include the possibility of exploiting the microorganism in biocatalytic reactions in the form of whole cells or cell membranes of N. oceanica CCMP1779 (hydrolysis and esterification reactions). Initially, the localization of lipolytic activities was studied and maximum lipolytic activity was found in cell debris (CDLA) of the microorganism. The enzyme revealed optimal lipolytic activity at 50 ° C and pH 7.0. Also, it exhibited stability in presence of different organic solvents while maintaining higher activity in non-polar solvents, namely n-octane (71%), even after 6 hours of incubation. The effect of various metal ions such as manganese (Mn2+) enhanced the activity by 68.25%. When the effect of surfactants was examined, the presence of a zwitterionic (CHAPS) and a non-ionic (Triton X-100) surfactant prevented the lipolytic activity of the membrane-bound enzyme and its release from the cell membrane. Substrate specificity for nitrophenyl esters (C2:0-C16:0) was analyzed under standard conditions and its preference to p-nitrophenyl palmitate was found. The maximum rate of esterification (vmax) was calculated at values 0.138, 0.257 and 0.054 mmole pNP/mg protein/min respectively for the three nitrophenyl esters (pNPC, pNPL, pNPP) and the Michaelis-Menten constants (Km) were found to be 0.352, 0.874 and 0.051 mM. The inhibition constants (KI) for p-nitrophenyl laurate and palmitate were found to be equal to 0.185 and 0.898 mM, respectively. The highest whole cell lipolytic activity was observed against p-nitrophenyl butyrate and the optimum pH for hydrolysis was determined at pH value 7.0. Treatment with the surfactants SDS, Triton X-100 and CHAPS results in a loss of lipolytic activity. Finally, the membrane-bound lipase from the microalgae Nannochloropsis oceanica CCMP1779 was evaluated for the synthesis of ethyl hexadecanoate (ethyl palmitate). Esterification reaction followed a ping-pong mechanism. The enzyme’s concentration, the speed of agitation, the effect of temperature on the reaction, as well as the effect of the carbon chain length of the primary alcohols (methanol, ethanol, n-propanol and n-butanol) was examined. The kinetic constants obtained were vmax =7.02 x 10-4 mmol ester/g E/h, Km (palmitic acid) = 86.96 mM and Km (ethanol) = 341.71 mM. Results showed that the properties of the membrane-bound lipolytic enzyme of N. oceanica CCMP1779 make it an interesting system for further investigation.

Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η βιοτεχνολογική αξιοποίηση και η βιοκαταλυτική συμπεριφορά του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica CCMP1779. Εξετάσθηκε ο ρόλος της αρχικής τιμής του pH της καλλιέργειας, της φωτοπεριόδου, της σύστασης του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας, της συγκέντρωσης του όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) και του νιτρικού νατρίου (NaΝO3) καθώς και της συνδυασμένης επίδρασης αυτών, στην παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων και στη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης και των επιμέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή της βιομάζας και η συσσώρευση των λιπιδίων και της χλωροφύλλης ευνοήθηκαν όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο με αρχική τιμή pH 8.0. Κατά την καλλιέργεια του μικροφύκους σε συνεχές φως, βρέθηκε η μέγιστη παραγωγή βιομάζας, ενώ το υψηλότερο λιπιδικό περιεχόμενο υπολογίσθηκε όταν η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε σε 16:8h φως:σκότος. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε στο θρεπτικό μέσο F/2 παρουσία όλων των απαραίτητων συστατικών και βιταμινών, επετεύχθη η υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας. Το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε κατά 10% αυξημένο όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο απουσία του νιτρικού νατρίου. Ενδιαφέρον παρουσίασε η μελέτη του ρόλου της σύστασης του θρεπτικού μέσου στη συγκομιδή του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 με τη χρήση μαγνητικών σωματιδίων Fe3O4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλότερη απόδοση συγκομιδής της βιομάζας επετεύχθη όταν εξαιρέθηκε από την καλλιέργεια η κύρια πηγή φωσφόρου (NaH2PO4). Όταν ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 (0.5 έως 5.0 g/L) και σταθερή αρχική συγκέντρωση NaΝO3, παρατηρήθηκε ότι ο τετραπλασιασμός της συγκέντρωσης του NaHCO3 (από 0.5 g/L στα 2.0 g/L) οδήγησε σε 1.9 φορές μεγαλύτερη συσσώρευση βιομάζας, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε ίσο με 32.2 % επί της ξηρής βιομάζας. Αντίστοιχα, διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης NaΝO3 (από 0 σε 0.1125 g/L) οδήγησε σε βελτίωση της παραγωγής βιομάζας κατά 54%, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο μειώθηκε από 41.6% σε 31.2%. Στη συνέχεια, με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης διερευνήθηκε η συνδυασμένη επίδραση της συγκέντρωσης του NaHCO3 και του NaΝO3 στην παραγωγή βιομάζας, χλωροφύλλης, λιπιδίων και επί μέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή βιομάζας ευνοήθηκε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 και NaΝO3 ίσες με 2.3 και 0.075 g/L, ενώ η υψηλότερη περιεκτικότητα σε λιπίδια (44.65%) καταγράφηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα και αζώτου (0.189 και 0.075 g/L αντίστοιχα). Το προφίλ των λιπαρών οξέων (FAS) βρέθηκε ότι κυριαρχείται από κορεσμένα (SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFAs), τα οποία αποτελούν το 88-95% των συνολικών λιπαρών οξέων, ενώ τα πολυακόρεστα λιπαρά (PUFAs) αντιπροσωπεύουν το 5-11%. Η βελτιστοποίηση που προέκυψε βασιζόμενη στο κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό έδειξε ότι ο συνδυασμός των 1.3 g/L NaHCO3 και 0.06 g/L NaNO3 μεγιστοποιεί τη συσσώρευση των λιπαρών οξέων και το περιεχόμενο σε MUFAs, ενώ οδηγεί στην ελάχιστη περιεκτικότητα σε PUFAs και εικοσαπενταενοϊκό οξύ (EPA). Ακολούθησε κλιμάκωση μεγέθους με τη καλλιέργεια του N. oceanica CCMP1779 σε φωτοβιοαντιδραστήρα όγκου 5L όπου η παραγωγή ξηρής βιομάζας βρέθηκε ίση με 1.47 g/L. Στα πειραματικά αποτελέσματα συγκαταλέγεται και η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις βιοκατάλυσης με την μορφή ολοκλήρων κυττάρων ή κυτταρικών μεμβρανών (αντιδράσεις υδρόλυσης και εστεροποίησης). Αρχικά, προσδιορίστηκε η τοπολογία των ενζυμικών δράσεων και η μέγιστη δραστικότητα εντοπίστηκε στις κυτταρικές μεμβράνες (CDLA) του μικροοργανισμού. Σε ότι αφορά τα βιοχημικά χαρακτηριστικά, το CDLA δρα βέλτιστα σε συνθήκες pH 7.0 και 50 oC. Επίσης, επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ διατήρησε υψηλότερη δραστικότητα σε μη-πολικούς διαλύτες και συγκεκριμένα το n-οκτάνιο (71%) έπειτα από 6 ώρες επώασης. Η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων όπως του μαγγανίου (Mn2+) ενίσχυσε τη δραστικότητα κατά 68.25%. Όταν εξετάσθηκε η επίδραση επιφανειοδραστικών ουσιών, προέκυψε ότι η παρουσία της αμφιτεριονικής (CHAPS) και της μη-ιονικής επιφανειοδραστικής ουσίας (Triton Χ-100) παρεμπόδισε τη λιπολυτική δράση του ενζύμου και παράλληλα δεν κατέστη δυνατή η αποδέσμευσή του από την κυτταρική μεμβράνη. Μελετήθηκε στη συνέχεια η υδρολυτική εξειδίκευση του έναντι εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2:0-C16:0) και βρέθηκε η προτίμηση του στον εστέρα της παρα – νιτρο – φαινόλης με παλμιτικό οξύ. Η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης (vmax) ήταν ίση με 0.138, 0.257 και 0.054 mmole pNP/mg protein/min, αντίστοιχα για τους τρεις εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με καπρυλικό, λαυρικό και παλμιτικό οξύ και η σταθερά Michaelis-Menten (Km) ίση με 0.352, 0.874 και 0.051 mM. Οι σταθερές παρεμπόδισης (KI) για τους εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με λαυρικό και παλμιτικό οξύ βρέθηκαν ίσες με 0.185 και 0.898 mM, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των ολόκληρων κύτταρων, έδειξε ότι το ενζυμικό σκεύασμα παρουσίασε μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μικρού μήκους ανθρακική αλυσίδα (εστέρας της παρα – νιτρο – φαινόλης με βουτυρικό οξύ) και η βελτιστη τιμή δράσης ήταν το pH 7.0. Επίσης εμφάνισε θερμοσταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες ενώ η κατεργασία του με επιφανειοδραστικές ουσίες (SDS, Triton X-100, CHAPS) προκάλεσε απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις εστεροποίησης λιπαρών οξέων με πρωτοταγείς αλκοόλες καταλυόμενες από το CDLA. Μελετήθηκε η συγκέντρωση του ενζυμικού σκευάσματος, η ταχύτητα ανάδευσης, η επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση καθώς και η επίδραση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας των πρωτοταγών αλκοολών (μεθανόλη, αιθανόλη, n-προπανόλη και n-βουτανόλη). Η αντίδραση εστεροποίησης του παλμιτικού οξέος με την αιθανόλη σε η-οκτάνιο καταλυόμενη από το CDLA φάνηκε να ακολουθεί μηχανισμό πινγκ-πονγκ, χωρίς αναστολή από το υπόστρωμα (εντός της συγκεκριμένης περιοχής συγκεντρώσεων υποστρωμάτων που εξετάσθηκαν). Οι κινητικές σταθερές της αντίδρασης εστεροποίησης βρέθηκαν ίσες με vmax=7.02•10-4 mmol εστέρα/g Ε.Σ./h, Κm,παλμιτικού οξέος=86.96 mM και Κm,αιθανόλης=341.71 mM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες του ενζυμικού συστήματος το οποίο βρίσκεται ακινητοποιημένο στις κυτταρικές μεμβράνες, το καθιστούν ένα ενδιαφέρον σύστημα για περαιτέρω διερεύνηση, ενώ για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης των ενζυμικών δράσεων του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779.