Μελέτη μηχανισμών επίδρασης υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης στα υπολείμματα αντιβιοτικών και εντομοκτόνων στο μέλι και αξιολόγηση της επίδρασής της στη διατροφική του αξία μέσω μεταβολομικών τεχνικών

Abstract

This doctoral thesis explores the use of High Hydrostatic Pressure (HHP) as a method to reduce antibiotic and pesticide residues in honey, as well as its effects on honey’s bioactive properties. Experimental trials included honey and additional food matrices(milk, water) spiked with antibiotics (STZ, HTC) and pesticides (bromopropylate, malathion, coumaphos, chlorpyrifos, tau-fluvalinate), and were conducted at MytilosPC, Kitros Pieria. Gas chromatography and liquid chromatography methods we reemployed to measure residue reductions, revealing HHP’s potential as a residue reduction method in honey. The research is structured by the following key studies: Pesticide Residue Reduction in Honey: Evaluates HHP's impact on pesticide residue levels and honey's physicochemical properties by spiking samples with specific pesticides. Key parameters, such as pressure (150, 400, 580 MPa), time (1, 3, 6, 12minutes), and temperature (4, 25, 35 °C), were tested. The results showed that while HHP reduced some pesticides (up to 30.6% for malathion), the antioxidant profile of honey was enhanced without significantly altering its quality. Antibiotic Residue Reduction in Food Matrices: Examines the effects of HHP on antibiotic residues in honey, milk, and water, alongside thermal and ultrasonic treatments. HHP proved most effective in water and milk for sulfathiazole (STZ) and tetracycline hydrochloride (HTC). A 580 MPa treatment for 6 minutes at 25 °C achieved the highest reduction rates, particularly for STZ in honey (over 90%).Impact of Storage on HHP-treated Honey: Following results showing limited HTC reduction in honey, this study examines the impact of storage (25 °C and -20 °C over180 days) on HHP-treated honey. Findings indicated increased crystallization and more effective residue reduction over time, with antibiotic half-lives in HHP-treated honey significantly shortened compared to untreated samples. Metabolomic Analysis of HHP-treated Honey: Compares the bioactive profile of HHP-treated honey to untreated honey through untargeted metabolomic analysis. Enhanced antioxidant properties and changes in crystal structure due to pressure were observed, contributing to honey's bio-functionality. Additionally, as detailed in Appendix B1, the study explored the mechanism of the process by examining how the initial concentrations of two antibiotics influenced the effectiveness of HHP under two different storage conditions: refrigeration and freezing of milk samples. The initial concentration impacted the method's efficiency for STZ in both storage conditions, whereas for HTC, significant differences were noted only during refrigerated storage. In summary, this thesis contributes to food science by:- Broadening the application of HHP for residue reduction beyond microbialinactivation.- Demonstrating HHP’s ability to improve honey’s bioactive profile and reduce residues in diverse food matrices.- Highlighting and uncovering mechanisms such as complex formation, residue oxidation and crystallization under pressure.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (HHP - High Hydrostatic Pressure) ως πιθανή επεξεργασία μείωσης των υπολειμμάτων αντιβιοτικών και εντομοκτόνων στο μέλι και πώς επηρεάζει τις βιοενεργές ιδιότητες του μελιού. Για τους σκοπούς αυτούς οπειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει τις ακόλουθες μελέτες: • Επίδραση της HHP στη συγκέντρωση υπολειμμάτων επιλεγμένων εντομοκτόνων και στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά επιβαρυμένων δειγμάτων μελιού. • Συγκριτική μελέτη της επίδρασης της HHP, θέρμανσης και επεξεργασίας με υπερήχους στη συγκέντρωση υπολειμμάτων αντιβιοτικών σε τεχνητά επιβαρυμένo μέλι και σύγκριση με δύο άλλες μήτρες (γάλα & νερό). • Μελέτη της επίδρασης της αποθήκευσης στην συγκέντρωση των υπολειμμάτων αντιβιοτικών και στην κρυστάλλωση μελιού επεξεργασμένου με HHP. • Μη στοχευμένη μεταβολομική μελέτη μελιού επεξεργασμένου με HHP και σύγκριση με ανεπεξέργαστο. Επιπλέον, συμπληρωματικά μελετήθηκε η επίδραση της φύσης της μήτρας στην αποτελεσματικότητα της HHP επεξεργασίας στα υπολείμματα αντιβιοτικών, όπως παρουσιάζεται στο Παράρτημα (Α & Β). Η συμπληρωματική αυτή διερεύνηση κρίθηκε σκόπιμη λόγω της παραλλακτικότητας των αποτελεσμάτων, της δεύτερης μελέτης, μεταξύ του μελιού και των δύο άλλων τροφίμων. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, πέρα από το μέλι που συμπεριλήφθηκε σε όλες τις μελέτες, χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον εξωγενώς επιβαρυμένα τρόφιμα (γάλα, νερό &μοντέλα τροφίμων) με τα αντιβιοτικά σουλφαθειαζόλη (sulfathiazole - STZ) και υδροχλωρική τετρακυκλίνη (hydrochloride tetracycline - HTC), καθώς και τα εντομοκτόνα bromopropylate, malathion, coumaphos, chlorpyrifos και taufluvalinate. Η επεξεργασία των δειγμάτων με HHP έγινε στις βιομηχανικές εγκαταστάσεις της εταιρίας Mytilos PC, Κίτρο Πιερίας. Στην πρώτη μελέτη εξετάστηκε η πιθανή επίδραση της HHP σε υπολείμματα εντομοκτόνων στο μέλι και μελετήθηκε η κινητική μείωσης. Για τους σκοπούς αυτούς, επιλέχθηκαν εντομοκτόνα που απαντώνται στο μέλι και αποτελούν κίνδυνογια την ανθρώπινη υγεία. Δείγματα μελιού επιβαρύνθηκαν με malathion, coumaphos, bromopropylate, tau-fluvalinate και chlorpyrifos και μέσω ενός πλήρως παραγοντικού στατιστικού σχεδιασμού διερευνήθηκε η επίδραση των βασικών παραμέτρων της διεργασίας: πίεση (150, 400 & 580 MPa), χρόνος επεξεργασίας (1, 3, 6 & 12 λεπτά) και θερμοκρασία (4, 25 & 35 ºC). Η οξείδωση των υπολειμμάτων παρουσία οξυγόνου στη συσκευασία των δειγμάτων εξετάστηκε ως πιθανός μηχανισμός μείωσής τους κατά την ΗΗΡ. Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των υπολειμμάτων πραγματοποιήθηκε με αέρια χρωματογραφία και οι μέγιστες μειώσεις που βρέθηκανήταν 30.6%, 28.6%, 21%, 15.7% και 10.6% για τα malathion, chlorpyrifos, coumaphos, bromopropylate και tau-fluvalinate, αντίστοιχα. Η HHP επεξεργασία δεν επηρέασε σημαντικά τα νομοθετημένα ποιοτικά χαρακτηριστικά του μελιού, ενώ καταγράφηκε ενίσχυση του αντι-οξειδωτικού προφίλ του. Αν και η εφαρμογή της ΗΗΡ δεν επέφερε εντυπωσιακές μειώσεις για όλες τις δραστικές που εξετάστηκαν, τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν ως επαρκώς ενθαρρυντικά, ώστε να επεκταθεί η μελέτη και σε άλλη κατηγορία υπολειμμάτων (αντιβιοτικά). Επιπλέον, θεωρήθηκε απαραίτητη η χρήση κλασικών μεθόδων (θέρμανση και επεξεργασία υπερήχων) μείωσης υπολειμμάτων ως επεξεργασίες-μέτρα σύγκρισης της αποτελεσματικότητας της HHP. Ως απόρροια των παραπάνω, στόχος της δεύτερης μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της HHP στα υπολείμματα HTC και STZ στο μέλι. Συγκριτικά αξιολογήθηκαν οι επιπτώσεις σε δύο διαφορετικές μήτρες, το γάλα και το νερό. Η επιλογή αυτή εξυπηρετεί τη μελέτη βασικών ειδών της ανθρώπινης διατροφής και ταυτόχρονα υγρών τροφίμων με σημαντικές μεταξύ τους διαφορές στις φυσικές τους ιδιότητες (ιξώδες, περιεκτικότητα σε σάκχαρα κ.ά.). Τρεις διαφορετικές πιέσεις δοκιμάστηκαν για την αποτελεσματικότητά τους και τελικά επιλέχθηκε η επεξεργασία στα 580 MPa για 6λεπτά στους 25 ºC. Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των αντιβιοτικών πραγματοποιήθηκε με υγρή χρωματογραφία και υγρή χρωματογραφία -φασματομετρία μάζας. Η HHP επεξεργασία συγκρίθηκε με τη θερμική επεξεργασία και την επεξεργασία υπερήχων. Η HHP βρέθηκε να είναι πιο αποτελεσματική από τις άλλες δύο επεξεργασίες και για τα δύο αντιβιοτικά στο νερό και στο γάλα. Η μείωση της STZ στο μέλι ήταν πάνω από 90%, ενώ η HTC έμεινε ανεπηρέαστη. Η υψηλότερη μείωση της HTC (76.4%) επιτεύχθει μετά από επεξεργασία του νερού με HHP, ενώ της STZ (94.3%) μετά από την επεξεργασία του μελιού με υπερήχους. Η μείωση των δύο αντιβιοτικών διέφερε ανάλογα το τρόφιμο, καταδεικνύοντας τη σημαντικότητα της φύσης του τροφίμου στην αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας. Έναυσμα για την μελέτη αποθήκευσης ήταν τα αποτελέσματα της δεύτερης μελέτης όπου, στην περίπτωση του μελιού, δε σημειώθηκε μείωση της HTC (σε αντίθεση με την STZ) ύστερα από την HHP επεξεργασία. Το εύρημα αυτό, σε συνδυασμό με βιβλιογραφικά δεδομένα που αναφέρουν μειώσεις στις συγκεντρώσεις αντιβιοτικών κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των τροφίμων, οδήγησε στο σχεδιασμό της τέταρτης μελέτης. Διερευνήθηκε η υπόθεση ότι η αποτελεσματικότητα της HHP (κυρίως για την HTC) θα μπορούσε να βελτιωθεί (έμμεσα) ύστερα από αποθήκευση των επεξεργασμένων δειγμάτων. Επιπλέον, εξετάστηκε ο συνδυασμός HHP και αποθήκευσης στη ρευστότητα του μελιού, καθώς αυτή συχνά επηρεάζεται από τις συνθήκες συντήρησης. Πιο συγκεκριμένα, ο πειραματικός σχεδιασμός της μελέτης αποθήκευσης είχε στόχο τη διερεύνηση του ρυθμού κρυστάλλωσης και της μείωσης των υπολειμμάτων STZ και HTC σε επιβαρυμένο μέλι κατά τη διάρκεια αποθήκευσης (180 ημέρες στους 25 & -20 ºC) μετά από HHP (580 MPa, 6 λεπτά, 25°C) επεξεργασία. Για τη συγκριτική αξιολόγηση της HHP χρησιμοποιήθηκε, επίσης, επεξεργασία υπερήχων (50 kHz, 200 W, 2 ώρες) και θερμική επεξεργασία (63 ºC, 30λεπτά), καθώς και ανεπεξέργαστα δείγματα επιβαρυμένου μελιού. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε 3 διαφορετικά χρονικά σημεία (30η, 90η & 180η ημέρα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό των κρυστάλλων κατά την αποθήκευση αυξήθηκε για τα δείγματα που επεξεργάστηκαν με HHP. Στο τέλος της περιόδου αποθήκευσης (180 ημέρες, 25 ºC) το ποσοστό των κρυστάλλων στο μέλι που επεξεργάστηκε με HHP ήταν 44.8%, σημαντικά υψηλότερο (p<0.05) από το αντίστοιχο ποσοστό για το ανεπεξέργαστο μέλι (35.7%). Τόσο για την HTC, όσο και για την STZ, η HHP οδήγησε σε σημαντική μείωση των υπολειμμάτων κατά την αποθήκευση, καταγράφοντας μικρότερη ημιζωή των δύο αντιβιοτικών από στις άλλες δύο επεξεργασίες. Στους 25 ºC, η ημιζωή της HTC στο ανεπεξέργαστο μέλι ήταν 223 ημέρες, υπερ-τριπλάσια από την ημιζωή στο επεξεργασμένο με ΗΗΡ μέλι (62ημέρες). Η ημιζωή της STZ στο ανεπεξέργαστο μέλι ήταν 281 ημέρες, σχεδόν τρεις φορές μεγαλύτερη από την ημιζωή στο επεξεργασμένο (106 ημέρες). Η μεταβολομική μελέτη επιβεβαίωσε τα οφέλη του ανεπεξέργαστου μελιού για την ανθρώπινη υγεία καθώς βρέθηκαν συστατικά (D-λιμονένιο, επικατεχίνη κ.ά.) με αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, καρδιοαγγειακές, μεταβολικές και νευροπροστατευτικές δράσεις. Ωστόσο, το μέλι που επεξεργάστηκε με HHP επηρέασε θετικά μεταβολικά μονοπάτια όπως ο μεταβολισμός της φαινυλαλανίνης, η βιοσύνθεση της αργινίνης, ο κύκλος του κιτρικού οξέος και ο μεταβολισμός της αργινίνης και της προλίνης. Τα μονοπάτια αυτά υποστηρίζουν την καρδιοαγγειακή, νευρολογική και μεταβολική υγεία. Συμπληρωματικά (Παράρτημα Β1), εμβαθύνοντας στο μηχανισμό της διεργασίας, μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης των δύο αντιβιοτικών κατά την ΗΗΡ σε δύο διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης (ψύξη και κατάψυξη) δειγμάτων γάλακτος. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου βρέθηκε να επηρεάζεται από την αρχική συγκέντρωση, και στις δύο συνθήκες αποθήκευσης για την STZ, ενώ για την HTC παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μόνο για την αποθήκευση στην ψύξη. Έχοντας παρατηρήσει ότι η υπερ-υψηλή πίεση είχε περιορισμένα αποτελέσματα στη μείωση των υπολειμμάτων εντομοκτόνων (πρώτη μελέτη) και σημαντικά αποτελέσματα έναντι των αντιβιοτικών αλλά με αποτελεσματικότητα που παραλάσσει ανάλογα το τρόφιμο (δεύτερη μελέτη), γεννήθηκε το ερώτημα για το ποιος είναι ο ρόλος της φύσης του τροφίμου στη μείωση των υπολειμμάτων κατά την ΗΗΡ. Για το λόγο αυτό, σε συμπληρωματική μελετη (Παράρτημα Β2) διερευνήθηκε ο ρόλος της σύστασης της μήτρας (πρωτεΐνες, λίπος, υδατάνθρακες) και του ιξώδους του στη μείωση των αντιβιοτικών STZ και HTC κατά την επεξεργασία ΗΗΡ (580MPa, 6 λεπτά, 25 °C) χρησιμοποιώντας μοντέλα τροφίμων. Η σύσταση και το ιξώδες της μήτρας βρέθηκε να ασκούν μια μεταβλητή επίδραση στη μείωση των υπολειμμάτων των αντιβιοτικών που μελετήθηκαν με HHP, υποδεικνύοντας διαφορετικούς μηχανισμούς αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συστατικών του τροφίμου και των αντιβιοτικών για τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας. Συμπερασματικά, οι καινοτομίες και η συμβολή στην επιστήμη της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: Η μεταβολομική μελέτη επιβεβαίωσε τα οφέλη του ανεπεξέργαστου μελιού για την ανθρώπινη υγεία καθώς βρέθηκαν συστατικά (D-λιμονένιο, επικατεχίνη κ.ά.) με αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, καρδιοαγγειακές, μεταβολικές και νευροπροστατευτικές δράσεις. Ωστόσο, το μέλι που επεξεργάστηκε με HHP επηρέασε θετικά μεταβολικά μονοπάτια όπως ο μεταβολισμός της φαινυλαλανίνης, η βιοσύνθεση της αργινίνης, ο κύκλος του κιτρικού οξέος και ο μεταβολισμός της αργινίνης και της προλίνης. Τα μονοπάτια αυτά υποστηρίζουν την καρδιοαγγειακή, νευρολογική και μεταβολική υγεία. Συμπληρωματικά (Παράρτημα Β1), εμβαθύνοντας στο μηχανισμό της διεργασίας, μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης των δύο αντιβιοτικών κατά την ΗΗΡ σε δύο διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης (ψύξη και κατάψυξη) δειγμάτων γάλακτος. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου βρέθηκε να επηρεάζεται από την αρχική συγκέντρωση, και στις δύο συνθήκες αποθήκευσης για την STZ, ενώ για την HTC παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μόνο για την αποθήκευση στην ψύξη. Έχοντας παρατηρήσει ότι η υπερ-υψηλή πίεση είχε περιορισμένα αποτελέσματα στη μείωση των υπολειμμάτων εντομοκτόνων (πρώτη μελέτη) και σημαντικά αποτελέσματα έναντι των αντιβιοτικών αλλά με αποτελεσματικότητα που παραλάσσει ανάλογα το τρόφιμο (δεύτερη μελέτη), γεννήθηκε το ερώτημα για το ποιος είναι ο ρόλος της φύσης του τροφίμου στη μείωση των υπολειμμάτων κατά την ΗΗΡ. Για το λόγο αυτό, σε συμπληρωματική μελετη (Παράρτημα Β2) διερευνήθηκε ο ρόλος της σύστασης της μήτρας (πρωτεΐνες, λίπος, υδατάνθρακες) και του ιξώδους του στη μείωση των αντιβιοτικών STZ και HTC κατά την επεξεργασία ΗΗΡ (580MPa, 6 λεπτά, 25 °C) χρησιμοποιώντας μοντέλα τροφίμων. Η σύσταση και το ιξώδες της μήτρας βρέθηκε να ασκούν μια μεταβλητή επίδραση στη μείωση των υπολειμμάτων των αντιβιοτικών που μελετήθηκαν με HHP, υποδεικνύοντας διαφορετικούς μηχανισμούς αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συστατικών του τροφίμου και των αντιβιοτικών για τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας. Συμπερασματικά, οι καινοτομίες και η συμβολή στην επιστήμη της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: • Η ανάδειξη της HHP ως υποσχόμενη μέθοδος για τη μείωση της συγκέντρωσης εντομοκτόνων και αντιβιοτικών στο μέλι. • Αναβάθμιση της βιολειτουργικότητας του μελιού μέσω της ΗΗΡ που αποδεικνύεται τόσο από τη βελτίωση του αντι-οξειδωτικού του προφίλ, όσο και από τη μεταβολομική ανάλυση. • Ανάδειξη του ρόλου της ΗΗΡ στη μείωση αντιβιοτικών κατά τη συντήρηση επεξεργασμένων δειγμάτων μελιού σε κατάψυξη. • Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που συνδέει την αύξηση του ποσοστού των κρυστάλλων στο μέλι μετά την επεξεργασία HHP με την αύξηση του αριθμού των φυσαλίδων λόγω της επεξεργασίας πίεσης.• Η ανάδειξη της ενισχυμένης βιοενεργής δράσης του μελιού, ύστερα από την επεξεργασία με HHP, με τη χρήση μεταβολομικής ανάλυσης. Οι κύριοι μηχανισμοί γύρω από την HHP που αναδείχθηκαν ήταν οι παρακάτω: • Σχηματισμός και διάσπαση σύμπλοκων μεταξύ υπολειμμάτων εντομοκτόνων και συστατικών του μελιού. Εξάρτηση του μηχανισμού από το μέγεθος της εφαρμοζόμενης πίεσης και τη διάρκεια της επεξεργασίας. • Οξείδωση υπολειμμάτων εντομοκτόνων λόγω παρουσίας οξυγόνου στη συσκευασία των δειγμάτων μελιού. • Σύνδεση του ποσοστού των κρυστάλλων του μελιού μετά την HHP επεξεργασία με την αύξηση του αριθμού των φυσαλίδων λόγω της εφαρμοζόμενης πίεσης.