Μελέτη της κινητικής και του φαινοτύπου κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού που λαμβάνουν θεραπεία με eribulin mesylate

Abstract

Breast cancer is the leading cause of cancer-related death among women worldwide. Understanding the mechanisms behind the metastatic process is crucial in improving treatments and enhancing patient survival. Many studies have focused on investigating tumor Epithelial-Mesenchymal-Transition (EMT), a dynamic process in which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. This transformation increases metastatic capacity, provides cancer stem cell (CSC) properties, enhances metastatic potential, allows immune evasion, and contributes to treatment resistance. Eribulin mesylate is an anti-mitotic drug, that functions as a microtubule polymerization inhibitor, and it is used to treat metastatic breast cancer (MBC). Pre-clinical studies suggest that Eribulin may reverse the EMT state in breast cancer cells, target CSC subsets, and reduce immune evasion of cancer cells mediated by PDL1 (Programmed Death Ligand 1). However, limited clinical data regarding its effectiveness are still available. Obtaining consecutive cancer tissue biopsies for research can be invasive, challenging, and potentially dangerous. Therefore, there is growing interest in using circulating cancer cells (CTCs) analysis through «liquid biopsy», as a tool for identifying new biomarkers for cancer treatment. CTC detection is recognized as an adverse prognostic factor in patients with both early and metastatic BC. Data suggest that the phenotypic characterization of CTCs can provide additional prognostic and predictive information. This thesis aimed to investigate the frequency, number, and phenotype (EMT/CSC/PDL1) of CTCs in patients with MBC undergoing treatment with Eribulin, known for its anti-mitotic activity and its impact on EMT, cancer stem cell properties and PDL1-mediated immune evasion. Additionally, the prognostic and predictive significance of the presence and phenotype of CTCs in this study population was explored. To achieve this, we conducted a CTC analysis using peripheral blood samples from patients with MBC treated with Eribulin at the Oncology Department of the University Hospital of Heraklion. Samples were collected at various time points during treatment and at relapse. We also documented the patients' clinical and pathological characteristics, objective response, progression-free interval, and overall survival to explore potential clinical correlations with our findings. We investigated the presence, kinetics, and phenotype of CTCs for EMT markers (TWIST1) and CSC markers (ALDH1), using fluorescent microscopy. Our study included different time points: before treatment initiation, eight days following treatment, and during disease progression. The analysis revealed that baseline detection of CTCs (D1C1) is associated with an increased risk of disease progression and mortality in patients with MBC. Monitoring CTCs also provided valuable prognostic information beyond the initial assessment. Our results indicated that, early in eribulin treatment, CTCs temporarily lose their EMT characteristics while retaining their stem-like (CSC) features. The CSC phenotype is prominent during disease progression, suggesting its role in resistance to Eribulin. Additionally, we found that a CTC sub-population, CSC+/partially EMT+, is an independent adverse prognostic factor for patient outcomes. Although this sub-population initially disappears during Eribulin treatment, it reemerges at disease progression. To further investigate the mechanisms of action and resistance of Eribulin, we examined the role of the immune checkpoint PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) in CTCs, given its known association with the EMT state in breast cancer cells. Assessing both EMT and PD-L1 expression in the primary tumor is emerging as a potential prognostic marker in various cancer types, including breast cancer. While mesenchymal markers and PD-L1 expression have been identified separately in CTCs of breast cancer patients, their co-expression in CTCs of MBC patients has not been previously reported until this study. Therefore, we aimed to investigate the co-expression of these markers, in both single and cluster CTCs from a small group of patients treated with Eribulin, to determine any potential correlation with patient outcomes. We observed an early action of Eribulin on the CTC state and identified distinct mesenchymal CTC (mCTCs) subpopulations with poor prognosis, such as PD-L1+mCTCs, for the first time. This highlights the clinical significance of early phenotypic characterization of CTCs in exploring the mechanisms of resistance and disease progression in real-time during Eribulin treatment. In conclusion, this thesis suggests that the detection, phenotypic analysis, and continuous monitoring of CTCs are crucial for prognostic assessment in patients with MBC treated with Eribulin. Future research involving larger patient groups will be necessary to confirm the prognostic value of CTCs in these patients and assess their role in monitoring treatment efficacy. Reliable and easily accessible biomarkers could enhance the use of Eribulin in BC treatment. Based on the findings of this thesis, CTC-based assays could significantly contribute to this goal.

Η ανάπτυξη μετάστασης αποτελεί την πιο συχνή αιτία θανάτου στις γυναίκες με καρκίνο του μαστού (ΚΜ), επομένως η κατανόηση της μεταστατικής διαδικασίας αποτελεί απαραίτητο βήμα για την ανάπτυξη νέων θεραπειών και τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών. Προς την κατεύθυνση αυτή, πληθώρα μελετών έχει εστιάσει στην ΕΜΤ (Επιθηλιο-Μεσεγχυματική-Μετατροπή) των όγκων, που αποτελεί μια δυναμική διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν μεσεγχυματικό φαινότυπο, και η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη μεταστατική ικανότητα, την απόκτηση ιδιοτήτων καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΒΚ, CSC), την ενίσχυση της μεταστατικής τους ικανότητας, της ανοσοδιαφυγής και της αντίστασης στη θεραπεία. Ο αντιμιτωτικός χημειοθεραπευτικός παράγοντας eribulin, αναστέλλει τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων και χορηγείται μετά την πρώτη γραμμή θεραπείας στο μεταστατικό ΚΜ (ΜΚΜ). Έχει δειχθεί σε προκλινικές μελέτες ότι επάγει την αντιστροφή της EMT κατάστασης των καρκινικών κυττάρων του μαστού, στοχεύει αποτελεσματικά το βλαστικό υποπληθυσμό (CSC) και μειώνει την έκφραση του PDL1 (Programmed Death Ligand 1) στα καρκινικά κύτταρα, ελαττώνοντας την ικανότητα ανοσοδιαφυγής του όγκου, ωστόσο δεν υπάρχουν μέχρι τώρα αρκετά κλινικά δεδομένα σε ασθενείς. Η επαναλαμβανόμενη λήψη καρκινικού ιστού στους ασθενείς για ερευνητικούς σκοπούς αποτελεί πρακτικά δυσχερή και δυνητικά επικίνδυνη επεμβατική διαδικασία, και κατά συνέπεια τα τελευταία χρόνια υπάρχει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον για την «υγρή βιοψία», και ειδικότερα την ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ, CTCs), ως εργαλείο ανάδειξης νέων βιοδεικτών για τη θεραπεία του καρκίνου. Η ανίχνευση και η καταμέτρηση των ΚΚΚ αποτελεί ένα τεκμηριωμένο δυσμενή προγνωστικό παράγοντα σε ασθενείς με πρώιμο και μεταστατικό ΚΜ, ενώ πληθώρα δεδομένων υποστηρίζουν ότι ο περαιτέρω φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ μπορεί να προσφέρει επιπλέον προγνωστική και προβλεπτική πληροφορία. Λαμβάνοντας υπόψη τις αντι-μιτωτικές ιδιότητες του eribulin και την επίδρασή του σε ΕΜΤ, βλαστικές ιδιότητες και την ικανότητα ανοσοδιαφυγής των καρκινικών κυττάρων μέσω PDL1, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης του στη συχνότητα ανίχνευσης, τον αριθμό, και κυρίως το φαινότυπο των ΚΚΚ, ως προς τους δείκτες EMT, CSC και PDL1 σε ασθενείς με ΜΚΜ που λαμβάνουν θεραπεία με eribulin. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η προγνωστική και προβλεπτική σημασία της παρουσίας και του φαινοτύπου των ΚΚΚ στους ασθενείς της μελέτης. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήσαμε αναλύσεις των ΚΚΚ στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΚΜ που έλαβαν eribulin στα πλαίσια της καθιερωμένης κλινικής πρακτικής στην Παθολογική Ογκολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου, σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της θεραπείας και στην υποτροπή της νόσου. Ακόμη, καταγράφηκαν τα κλινικο-παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, η αντικειμενική ανταπόκριση, το διάστημα ελεύθερο προόδου νόσου και η συνολική επιβίωση των ασθενών για να διερευνηθούν οι πιθανές κλινικές συσχετίσεις των ευρημάτων.Στην πλειοψηφία των ασθενών διερευνήθηκε η παρουσία, η κινητική και ο φαινότυπος των ΚΚΚ ως προς τους δείκτες ΕΜΤ (TWIST1) και CSC (ALDH1) μέσω μικροσκοπίας φθορισμού, εστιάζοντας σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, πριν από την έναρξη της θεραπείας, 8 ημέρες μετά και κατά την εξέλιξη της νόσου. Η ανάλυση έδειξε ότι η ανίχνευση των ΚΚΚ κατά την έναρξη της θεραπείας με eribulin σχετίζεται με υψηλό κίνδυνο εξέλιξης της νόσου και θανάτου σε ασθενείς με ΜΚΜ, ενώ η παρακολούθηση των ΚΚΚ πρόσθεσε επιπλέον προγνωστικές πληροφορίες σε σχέση με την αρχική αξιολόγησή τους. Επιπλέον, σύμφωνα με τα αποτελέσματα φάνηκε ότι τα ΚΚΚ των ασθενών χάνουν προσωρινά τα EMT χαρακτηριστικά τους νωρίς κατά τη διάρκεια της θεραπείας με eribulin, ωστόσο διατηρούν τα βλαστικά (CSC) χαρακτηριστικά τους. Επιπλέον, ο βλαστικός φαινότυπος βρέθηκε να επικρατεί στα ΚΚΚ κατά την εξέλιξη της νόσου, υποδεικνύοντας τον εξέχοντα ρόλο του στην αντίσταση στο eribulin. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στο υποσύνολο CSC+/μερικώς EMT+ των ΚΚΚ, το οποίο βρέθηκε ότι αποτελεί ανεξάρτητο δυσμενή προγνωστικό ρόλο στην έκβαση των ασθενών, και ενώ αρχικά εξαλείφθηκε με τη θεραπεία, στη συνέχεια επανεμφανίστηκε στην εξέλιξη της νόσου.Επιπρόσθετα, στα πλαίσια της αναζήτησης των μηχανισμών δράσης και αντίστασης του eribulin, μελετήθηκε ο ρόλος της έκφρασης του σημείου ανοσολογικού ελέγχου PD-L1 στα ΚΚΚ, καθώς έχει ήδη συσχετιστεί με την κατάσταση EMT σε καρκινικά κύτταρα μαστού. Η συνδυασμένη αξιολόγηση της EMT και του PD-L1 στον αρχικό όγκο έχει προταθεί ως προγνωστικός δείκτης σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του μαστού. Η έκφραση μεσεγχυματικών δεικτών και του PD-L1 έχει αποδειχθεί ξεχωριστά σε ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, αλλά η συν-έκφραση αυτών δεν είχε αναφερθεί μέχρι την παρούσα μελέτη σε ΚΚΚ ασθενών με ΜΚΜ. Με βάση τα παραπάνω, σε μία υπο-ομάδα των ίδιων ασθενών αξιολογήσαμε τη συν-έκφραση μεσεγχυματικών δεικτών και PD-L1, σε μoμονωμένα ΚΚΚ αλλά και συστάδες ΚΚΚ, την επίδραση του eribulin στους συγκεκριμένους υποπληθυσμούς ΚΚΚ και τη συσχέτισή τους με την έκβαση των ασθενών. Ο φαινότυπος των ΚΚΚ αναλύθηκε πριν την έναρξη της θεραπείας και 8 ημέρες μετά, χρησιμοποιώντας μια νέα μεθοδολογία με τετραπλή χρώση για την ανίχνευση επιθηλιακών, μεσεγχυματικών δεικτών και του PD-L1. Τα αποτελέσματα της μελέτης αποδεικνύουν ότι το PD-L1 εκφράζεται τόσο στα επιθηλιακά όσο και στα μεσεγχυματικά ΚΚΚ, αλλά κυρίως στον υποπληθυσμό που είναι έντονα μεσεγχυματικός. Επίσης, διαπιστώθηκε η πρώιμη δράση του eribulin στην ΕΜΤ κατάσταση των KKK και εντοπίστηκαν διακριτοί υποπληθυσμοί μεσεγχυματικών ΚΚΚ (mCTCs), όπως τα PD-L1+mCTCs, οι οποίοι συσχετίστηκαν με χειρότερη πρόγνωση. Τονίζεται λοιπόν η κλινική σημασία του φαινοτυπικού χαρακτηρισμού των ΚΚΚ νωρίς κατά τη διάρκεια της θεραπείας με eribulin στη διερεύνηση μηχανισμών αντίστασης και εξέλιξης της νόσου σε πραγματικό χρόνο. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή παρέχει σαφείς ενδείξεις ότι η ανίχνευση, η φαινοτυπική ανάλυση, αλλά και η συνεχόμενη παρακολούθηση των ΚΚΚ διαδραματίζουν σημαντικό προγνωστικό ρόλο σε ασθενείς με MKM που λαμβάνουν θεραπεία με eribulin. Μελλοντικές μελέτες που θα περιλαμβάνουν μεγαλύτερες ομάδες ασθενών θα βοηθήσουν στην επιβεβαίωση της προγνωστικής αξίας των ΚΚΚ σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με eribulin και στην αξιολόγηση του ρόλου τους στην παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Αξιόπιστοι και εύκολα προσβάσιμοι βιοδείκτες θα ήταν μεγάλης σημασίας για την επέκταση της χρήσης του Eribulin σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές για τον ΚΜ, και σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, θεωρούμε ότι οι αναλύσεις που βασίζονται σε ΚΚΚ ενδέχεται να συμβάλουν σε μεγάλο βαθμό προς αυτή την κατεύθυνση.