Περίληψη
Τα ανώριμα ωάρια μπορούν να αποτελέσουν εναλλακτική πηγή ωαρίων για τις τεχνολογίες υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ΤΥΑ). Τα ωάρια αυτά μπορούν να ληφθούν από ασθενείς που υποβάλλονται σε διάφορα πρωτόκολλα ελεγχόμενης υπερδιέγερσης των ωοθηκών (ΕΥΩ), όπως τα συμβατικά «πλήρη» (πΕΥΩ) ή τα λιγότερο επιθετικά «ήπια» (ηΕΥΩ) πρωτόκολλα. Αυτά τα λεγόμενα «εναπομείναντα» ωάρια μπορούν να αυξήσουν την απόδοση των συνολικών διαθέσιμων ωαρίων, ιδίως για ασθενείς με κακή ανταπόκριση ή για εκείνες που έχουν μη συγχρονισμένη ομάδα ωοθυλακίων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο να αξιολογήσει τις επιδράσεις δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων COH, μιας διέγερσης με αγωνιστή εκλυτικής ορμόνης γοναδοτροπινών (GnRH) (πΕΥΩ) και, μιας διέγερσης με ανταγωνιστή GnRH (ηΕΥΩ), στην ορθή δομή των φρέσκων ανθρώπινων ανώριμων ωαρίων σταδίου γνωστού ως germinal vesicle (GV), για να εξεταστεί η υπερδομή των καλά διατηρημένων οργανιδίων ως δείκτης διατήρησης της ποιότητας των GV ωαρίων. Φρέσκα GV ωοκύτταρα ανακτήθ ...
Τα ανώριμα ωάρια μπορούν να αποτελέσουν εναλλακτική πηγή ωαρίων για τις τεχνολογίες υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ΤΥΑ). Τα ωάρια αυτά μπορούν να ληφθούν από ασθενείς που υποβάλλονται σε διάφορα πρωτόκολλα ελεγχόμενης υπερδιέγερσης των ωοθηκών (ΕΥΩ), όπως τα συμβατικά «πλήρη» (πΕΥΩ) ή τα λιγότερο επιθετικά «ήπια» (ηΕΥΩ) πρωτόκολλα. Αυτά τα λεγόμενα «εναπομείναντα» ωάρια μπορούν να αυξήσουν την απόδοση των συνολικών διαθέσιμων ωαρίων, ιδίως για ασθενείς με κακή ανταπόκριση ή για εκείνες που έχουν μη συγχρονισμένη ομάδα ωοθυλακίων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο να αξιολογήσει τις επιδράσεις δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων COH, μιας διέγερσης με αγωνιστή εκλυτικής ορμόνης γοναδοτροπινών (GnRH) (πΕΥΩ) και, μιας διέγερσης με ανταγωνιστή GnRH (ηΕΥΩ), στην ορθή δομή των φρέσκων ανθρώπινων ανώριμων ωαρίων σταδίου γνωστού ως germinal vesicle (GV), για να εξεταστεί η υπερδομή των καλά διατηρημένων οργανιδίων ως δείκτης διατήρησης της ποιότητας των GV ωαρίων. Φρέσκα GV ωοκύτταρα ανακτήθηκαν από γυναίκες-δότες που έδωσαν τη συγκατάθεσή τους και υποβλήθηκαν σε ΤΥΑ λόγω παραγόντων είτε υπογονιμότητας σαλπίγγων είτε ανδρών. Η ΕΥΩ επιτεύχθηκε με: 1) ένα τυπικό πρωτόκολλο μακράς διάρκειας, με αγωνιστές GnRH (πρωτόκολλο πΕΥΩ) ή 2) ένα ήπιο πρωτόκολλο, με ανταγωνιστές GnRH (πρωτόκολλο ηΕΥΩ). Μετά την ανάκτηση, τα ωοκύτταρα πλύθηκαν σε διάλυμα φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS), στερεώθηκαν σε 2,5% γλουταραλδεΰδη/PBS και υποβλήθηκαν σε τυπική προπαρασκευή για μικροσκοπία φωτός (ΜΦ) και μικροσκοπία διέλευσης ηλεκτρονίων (ΜΔΗ). Τα παρακάτω παράμετρα αξιολογήθηκαν με ΜΦ και ΜΔΗ και λήφθηκαν υπόψη για την ποιοτική αξιολόγηση της υπερδομικής διατήρησης των ωοκυττάρων: γενικά χαρακτηριστικά (συμπεριλαμβανομένου του σχήματος και των διαστάσεων του ωοκυττάρου)· μορφολογία του πυρήνα, του πυρηνίσκου, της χρωματίνης και του πυρηνικού περιβλήματος (συμπεριλαμβανομένης της ακεραιότητας της πυρηνικής μεμβράνης)· μικροτοπογραφία, τύπος και ποιότητα των οργανιδίων· σχήμα, αριθμός και διαστάσεις των μιτοχονδρίων· παρουσία και έκταση των κενοτοπίων του οοπλάσματος· θέση, αριθμός και διαστάσεις των φλοιωδών κοκκίων· ακεραιότητα του ωολέμματος και μοτίβο μικρολαχνών· εμφάνιση του περιβιτελλινικού χώρου (πλάτος, παρουσία θραυσμάτων)· υφή της ζώνης διαφανούς. Τα περισσότερα ωοκύτταρα πΕΥΩ και ηΕΥΩ ήταν καλά διατηρημένα και έδειξαν στρογγυλό και κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα. Ο πυρηνίσκος ήταν δικτυωτός και συνδεδεμένος με πυκνές ετεροχρωματινικές κηλίδες και στις δύο ομάδες ωοκυττάρων. Τα μιτοχόνδρια ήταν συνήθως τοποθετημένα σε περιπυρηνική θέση, μερικές φορές συνδεδεμένα με μικρά κυστίδια· στην ομάδα ηΕΥΩ, έδειξαν σημαντική αύξηση στον αριθμό, σε σχέση με το πΕΥΩ. Πολλά ηλεκτροαρνητικά και μεμβρανοδεμένα κενοτόπια βρίσκονταν κοντά στον πυρήνα και στις δύο ομάδες, αλλά εμφανίζονταν σημαντικά μεγαλύτερα στα ωοκύτταρα πΕΥΩ από ότι στα ωοκύτταρα ηΕΥΩ. Τα φλοιώδη κοκκία βρίσκονταν τόσο στην υποπλασματική περιοχή όσο και διασκορπισμένα σε όλο το ωόπλασμα, αν και λιγότερο άφθονα· ο αριθμός των φλοιωδών κοκκίων ήταν σημαντικά υψηλότερος στα ωοκύτταρα ηΕΥΩ, σε σύγκριση με αυτά του πΕΥΩ. Μια άθικτη και συνεχιζόμενη διαφανής ζώνη ήταν παρούσα και στις δύο ομάδες· οι μικρολάχνες ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένες και στις δύο ομάδες, με ορισμένες περιοχές αραιώσεων στα ωοκύτταρα πΕΥΩ. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης έδειξαν οργανιδιακές ειδικές αλλοιώσεις στα ωοκύτταρα που παρατηρήθηκαν, πιθανώς σχετιζόμενες με το εκάστοτε εφαρμοσμένο πρωτόκολλο ΕΥΩ. Ειδικότερα, ο σημαντικά χαμηλότερος αριθμός μιτοχονδρίων και το μεγαλύτερο μέγεθος των κενοτοπίων στα ωοκύτταρα πΕΥΩ, σε σχέση με αυτά που παρατηρήθηκαν στα ωοκύτταρα ηΕΥΩ, μπορεί να υποδηλώνουν ότι ορισμένα μικροπεδία των ωοκυττάρων στο στάδιο GV ενδέχεται να επηρεάζονται από την ορμονική διέγερση.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Immature oocytes can be an alternative source of oocytes for Assisted Reproductive Technologies (ARTs). These oocytes can be retrieved by patients undergoing different controlled ovarian hyperstimulation protocols (COH), such as the conventional “full” (fCOH) or the less aggressive “mild” (mCOH) protocols. These, so-called “leftover” oocytes can increase the yield of total available oocytes, especially for poor responder patients or those having an unsynchronized cohort of follicles. The present PhD thesis aimed to evaluate the effects of two different COH protocols, a GnRH agonist (fCOH) stimulation and a GnRH antagonist (mCOH) stimulation, on the fine structure of fresh human immature GV-stage oocytes, to consider the ultrastructure of well-preserved organelles as indicator of GV quality preservation. Fresh GVs were retrieved from consenting donor women undergoing ARTs due to tubal or male infertility factors. COH was achieved by: 1) a standard long protocol, with GnRH agonists (fCOH ...
Immature oocytes can be an alternative source of oocytes for Assisted Reproductive Technologies (ARTs). These oocytes can be retrieved by patients undergoing different controlled ovarian hyperstimulation protocols (COH), such as the conventional “full” (fCOH) or the less aggressive “mild” (mCOH) protocols. These, so-called “leftover” oocytes can increase the yield of total available oocytes, especially for poor responder patients or those having an unsynchronized cohort of follicles. The present PhD thesis aimed to evaluate the effects of two different COH protocols, a GnRH agonist (fCOH) stimulation and a GnRH antagonist (mCOH) stimulation, on the fine structure of fresh human immature GV-stage oocytes, to consider the ultrastructure of well-preserved organelles as indicator of GV quality preservation. Fresh GVs were retrieved from consenting donor women undergoing ARTs due to tubal or male infertility factors. COH was achieved by: 1) a standard long protocol, with GnRH agonists (fCOH protocol) or 2) a mild protocol, with GnRH antagonists (mCOH protocol). After retrieval, oocytes were washed in phosphate buffered saline (PBS) solution, fixed in 2.5% glutaraldehyde/PBS and subjected to standard preparative for light (LM) and transmission electron microscopy (TEM). The following parameters were evaluated by LM and TEM and taken into consideration for qualitative assessment of the ultrastructural preservation of oocytes: general features (including oocyte shape and dimensions); morphology of the nucleus, nucleolus, chromatin and nuclear envelope (including nuclear membrane integrity); microtopography, type and quality of the organelles; mitochondria shape, number and dimensions; presence and extent of ooplasmic vacuolization; position, number and dimensions of cortical granules; integrity of the oolemma and microvillus pattern; appearance of the perivitelline space (width, presence of fragments); zona pellucida texture. Most of fCOH and mCOH oocytes were well preserved and showed a roundish and centrally located nucleus. The nucleolus was reticulated and connected with dense heterochromatin spots in both oocyte groups. Mitochondria were usually located in a perinuclear position, sometimes associated to small vesicles; in the mCOH group, they showed a significant increase in the number, respect to fCOH. Numerous electron negative and membrane-bounded vacuoles were located close to the nucleus in both groups, but they appeared significantly larger in fCOH than in mCOH oocytes. Cortical granules were located both in the subplasmalemmal area and dispersed throughout the whole ooplasm, even if less abundant; the number of cortical granules was significantly higher in mCOH oocytes, compared to the fCOH ones. An intact and continuous zona pellucida were present in both groups; microvilli were uniformly distributed in both groups, with some areas of rarefactions in fCOH oocytes. The data of the present study showed organelle-specific alterations in the oocytes observed, probably related to the applied COH protocol. In particular, the significantly lower number of mitochondria and the biggest size of vacuoles in fCOH oocytes TEM: transmission electron microscopy, respect to what observed in mCOH oocytes, may suggest that some microdomains of the GV-stage oocytes may be affected by the hormonal stimulation.
περισσότερα