Μοριακή και ανοσογενετική ανάλυση με μεθοδολογία αλληλούχησης μεγάλης κλίμακας σε λεμφοϋπερπλασίες και προλευχαιμικές οντότητες

Abstract

Monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL) is considered a precursor stage of chronic lymphocytic leukemia (CLL), and its study has revealed a series of biological similarities but also differences with CLL. Specifically, HC-MBL and CLL show similar immunogenetic repertoires, while LC-MBL shows a highly unique immunoglobulin repertoire with few CLL-specific B cell receptor (BcR) sequences. However, most relevant studies focused on low-throughput methodologies, thus hindering the extraction of solid conclusions. Here, we studied the immunogenetic repertoire of the BcR and T cell receptor (TcR) in LC-MBL using state-of-the-art high-throughput methodologies. Comparisons were performed between healthy donors and patients with CLL in order to elucidate the role of the microenvironment in CLL ontogenesis. The first part of this thesis concerned a systematic study of the BcR in samples from healthy donors with or without LC-MBL. Clonality in LC-MBL samples was found significantly increased compared to normal B cells, though presented with heterogeneity. These findings highlight the distinct BcR characteristics of MBL and CLL in terms of the exact nature of the relevant microenvironmental interactions. In the next part of the thesis, oligoclonality was also observed in the TcR repertoire of LC-MBL, however it was less extensive compared to CLL but greater than in healthy donors without MBL. Overall, our data provide evidence that both the LC-MBL and CLL TcR repertoires are influenced by antigen interaction. However, LC-MBL exhibited distinct features, indicating a different nature for antigens implicated in this entity compared to CLL. In other words, MBL progression to CLL may start with the selection of a B cell clone with the characteristic CLL phenotype but without any leukemic potential. Subsequently, genetic lesions or additional signals from the microenvironment, including T cell-derived stimuli may drive CLL ontogenesis. This thesis contributes to a better understanding of CLL development and highlights the significance of antigen interactions in shaping immune repertoires. The thesis also introduces tools for immunogenetic analysis as it introduced a novel method of analysis of somatic hypermutation (SHM) in complex repertoires and large-scale data.

Η μονοκλωνική B λεμφοκυττάρωση (ΜΒΛ) θεωρείται ως πρόδρομο στάδιο της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (ΧΛΛ), με τη μελέτη της να έχει αποκαλύψει μια σειρά βιολογικών ομοιοτήτων αλλά και διαφορών με τη ΧΛΛ. Ειδικότερα, οι HC-MBΛ και ΧΛΛ εμφανίζουν παρόμοια ανοσογενετικά ρεπερτόρια, ενώ η LC-MBΛ φαίνεται να έχει ένα εξαιρετικά διακριτό άνοσο ρεπερτόριο με ελάχιστες, «ειδικές για τη ΧΛΛ» αλληλουχίες Β κυτταρικού υποδοχέα (ΒκΥ). Ωστόσο, οι περισσότερες σχετικές μελέτες βασίστηκαν σε μεθοδολογίες μικρής κλίμακας, καθιστώντας δύσκολη την εξαγωγή συμπαγών συμπερασμάτων. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε για πρώτη φορά το ανοσογενετικό ρεπερτόριο του ΒκΥ και του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (ΤκΥ) στη LC-MBΛ χρησιμοποιώντας σύγχρονες μεθοδολογίες υψηλής απόδοσης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν συγκρίσεις με υγιείς δότες και ασθενείς με ΧΛΛ προκειμένου να διασαφηνιστούν τα όρια μεταξύ των διαφορετικών οντοτήτων και να διευκρινιστεί ο ρόλος του μικροπεριβάλλοντος στην οντογένεση της ΧΛΛ. Το πρώτο μέρος αυτής της διατριβής αφορούσε στη συστηματική μελέτη του ΒκΥ σε δείγματα από υγιείς δότες με ή χωρίς LC-MBL. Η κλωνικότητα των δειγμάτων LC-MBΛ ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τα αντίστοιχα δείγματα των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων, εμφάνισε, ωστόσο, μεγάλη ετερογένεια. Τα συνολικά ευρήματα υπογραμμίζουν τα ξεχωριστά χαρακτηριστικά του ΒκΥ μεταξύ ΜΒΛ και ΧΛΛ όσον αφορά στην ακριβή φύση των σχετικών μικροπεριβαλλοντικών αλληλεπιδράσεων. Στο επόμενο μέρος της διατριβής μελετήθηκε με τεχνικές μεγάλης κλίμακας το ρεπερτόριο του ΤκΥ, όπου παρατηρήθηκε και πάλι ολιγοκλωνικότητα στο ρεπερτόριο της LC-MBΛ, η οποία ήταν μικρότερης έκτασης σε σύγκριση με τη ΧΛΛ αλλά μεγαλύτερης σε σχέση με τους υγιείς δότες χωρίς MBΛ. Συνολικά, οι δύο μελέτες καταδεικνύουν ότι τα άνοσα ρεπερτόρια των LC-MBΛ και ΧΛΛ επηρεάζονται από αντιγονικές επιδράσεις. Ωστόσο, η LC-MBΛ παρουσιάζει διακριτά χαρακτηριστικά, υποδεικνύοντας διαφορετική φύση για τα αντιγόνα που εμπλέκονται σε αυτήν την οντότητα σε σύγκριση με τη ΧΛΛ. Επομένως, η πρόοδος της ΜΒΛ σε ΧΛΛ μπορεί να ξεκινήσει με την επιλογή ενός κλώνου Β λεμφοκυττάρων με το χαρακτηριστικό φαινότυπο της ΧΛΛ αλλά χωρίς ισχυρό λευχαιμικό δυναμικό. Στη συνέχεια, γενετικές βλάβες ή πρόσθετα σήματα από το μικροπεριβάλλον, συμπεριλαμβανομένων των ερεθισμάτων που προέρχονται από τα Τ λεμφοκύτταρα μπορεί να καθοδηγήσουν την οντογένεση της ΧΛΛ. Η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της ανάπτυξης της ΧΛΛ και υπογραμμίζει τη σημασία των αντιγονικών αλληλεπιδράσεων στη διαμόρφωση των άνοσων ρεπερτορίων. Η διατριβή περιλάμβανε την ανάπτυξη βιοπληροφορικών εργαλείων ανοσογενετικής ανάλυσης. Πιο συγκεκριμένα, η τρίτη ερευνητική μελέτη αναφέρεται σε μια νέα μέθοδο ανάλυσης της Σωματικής Υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ) σε δεδομένα μεγάλης κλίμακας από περιπτώσεις σύνθετων άνοσων ρεπερτορίων, κάτι που ως τώρα δεν ήταν εφικτό.