Υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία με αντιγονο-ειδικά Τ-λεμφοκύτταρα έναντι παθογόνων και καρκίνου

Abstract

Allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HSCT), in which stem hematopoietic stem cells are derived from a healthy donor, is the only radical treatment to date for poor prognosis leukemia. Despite the significant scientific progress that has been made in the field and the better training of medical staff today compared to previous decades, serious transplant complications have not been fully addressed. Two of the most important complications are recurrence of the disease and viral infections. Donor lymphocyte infusions (DLIs) can cause haematological remission after relapse in transplant patients, even without prior chemotherapy. However, T cells’ alloreactivity against antigens other than leukemic clones is associated with an increased risk of developing graft-versus-host disease (GvHD). T-cell immunotherapy with chimeric antigen receptors (CAR-Ts) or genetically modified T-cell receptor (TCR) has opened new horizons for the treatment of malignancies. However, the lack of appropriate target antigens in malignant myeloid cells renders CAR-T treatment ineffective in patients with refractory acute myeloid leukemia, while the incorrect coupling of the artificial with the endogenous TCR and restrictive barriers of the HLA system significant barriers to the wider clinical application of TCR-Ts.On the other hand, viral infections are a major cause of transplant-related morbidity and mortality (17-20%), significantly increasing the financial cost. In cases of previous exposure of the donor to specific pathogens, DLIs contain pathogen-specific memory T cells, capable of treating the infection through the action of the graft against infections [Graft vs Infection (GvI)]. However, their wider application in the treatment of post-transplant viral infections is limited by the low frequency of anti-viral T cells and the high frequency of alloreactive T cells.Utilizing the cytotoxic activity of the cells of the immune system with the adopted transfer of anti-viral or anti-cancer T cells, can significantly help in the treatment of viral infections and recurrences of leukemia after allo-HSCT. The unique ability of Dendritic Cells (DCs) to induce the production of specific immune responses by naive T cells raises a research interest so that they can be used in cellular immunotherapy of infections in immunocompromised patients and of advanced stage malignancies. However, their low blood content and the complex / expensive methodology of their generation by blood monocytes, prevent their widespread clinical use. An alternative source of DCs generation are hematopoietic stem cells (CD34+ cells), however, access to CD34+ cell sources is limited and the number of DCs produced is rarely sufficient for clinical application. On the other hand, non-transplantable umbilical cord blood units (UCBU) could be an immediately available, source of CD34+ cells for DCs generation.Ιn the following dissertation we investigated the possibility of producing non-genetically modified, specific T cells against leukemia-related antigens, (leukemia-specific T cells - Leuk-STs) Leuk-STs specific for Wilms Tumor 1 antigens (WT1), Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and also, against leukemia-related antigens and viral antigens simultaneously (LEukemia-VIrus specific T cells - LEVIS) LEVIS specific for WT1, PRAME, TERT (Telomerase Reverse Transcriptase), Survivin and for cytomegalovirus (CMV), human adenovirus (HAdV), EpsteinBarr (EBV) and Polyoma Virus (BK) antigens from UCBUs deemed unsuitable for allogeneic hematopoietic cell transplantation. Taking advantage of the non-transplanted UCBUs and optimizing the culture conditions, we achieved the production of myeloid DCs from CD34+ cells in clinically translatable doses. The produced DCs were used as antigen-presenting cells to perform multiple stimulations of autologous, naive T cells to produce clinically translatable doses of polyclonal Leuk-STs and LEVIS. The specific T cells produced contained CD8+ and CD4+ T-cell subpopulations, expressed memory markers and maintained very low or barely detectable expression levels of PD-1, CTLA4, TIM3 and LAG3 throughout culture, suggesting that prolonged exposure to antigens did not adversely affect their phenotype and Th-1 function in vitro. Furthermore, they showed strong specificity against all targeted antigens (WT1, PRAME and WT1, PRAME, TERT, Survivin, CMV, AdV, EBV, BKV) and strong cytotoxic activity in vitro.Overall, we provide an example of a circular economy utilizing non-transplantable UCBUs and a platform for the future creation of Leuk-STs and / or LEVIS banks as readily available, off-the-shelf "third party" cellular products and a cost-effective treatment for many patients with opportunistic infections that do not respond to standard antiviral medication or with recurrent leukemias after hematopoietic cell transplantation.

Η αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (αλλοΜΑΚ) , όπου τα στελεχιαία αιμοποιητικά κύτταρα προέρχονται από υγιή δότη, αποτελεί τη μοναδική μέχρι σήμερα ριζική θεραπεία της λευχαιμίας κακής πρόγνωσης. Παρά τη σημαντική επιστημονική πρόοδο που έχει επιτευχθεί στο πεδίο και την αρτιότερη κατάρτιση του ιατρικού προσωπικού σήμερα συγκριτικά με τις προηγούμενες δεκαετίες, σοβαρές μεταμοσχευτικές επιπλοκές δεν έχουν αντιμετωπιστεί πλήρως. Δύο από τις σημαντικότερες επιπλοκές αυτές είναι η υποτροπή της νόσου και την εμφάνιση ιογενών λοιμώξεων. Οι επανειλημμένες εγχύσεις μη ειδικών Τ- λεμφοκυττάρων του δότη (donor lymphocyte infusions-DLIs) μπορούν να επιφέρουν αιματολογική ύφεση μετά από υποτροπή της νόσου σε μεταμοσχευμένους ασθενείς, ακόμη και χωρίς να προηγηθεί χημειοθεραπεία. Ωστόσο, η αλλοδραστικότητα των Τ λεμφοκυττάρων έναντι αντιγόνων πέραν των λευχαιμικών κλώνων, συνοδεύεται από αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GvHD). Η ανοσοθεραπεία με Τ λεμφοκύτταρα που φέρουν χιμαιρικούς αντιγονικούς υποδοχείς (CAR-Ts) ή γενετικά τροποποιημένο Τ-κυτταρικό υποδοχέα (T-cell receptor, TCR) άνοιξε νέους ορίζοντες για τη θεραπεία κακοηθειών. Η έλλειψη, ωστόσο, κατάλληλων αντιγόνων-στόχων στα κακοήθη μυελοειδή κύτταρα καθιστά μη αποτελεσματική τη θεραπεία με CAR-T, ασθενών με ανθεκτική οξεία μυελοειδή λευχαιμία ενώ η λάθος σύζευξη του τεχνητού με τον ενδογενή TCR και οι περιοριστικοί φραγμοί του HLA-συστήματος, προβάλουν ως σημαντικά εμπόδια για την ευρύτερη κλινική εφαρμογή των TCR-Ts. Από την άλλη πλευρά, οι ιογενείς λοιμώξεις αποτελούν σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνητότητας σχετιζόμενης με τη μεταμόσχευση (17-20%), αυξάνοντας σημαντικά και το οικονομικό κόστος. Στις περιπτώσεις προηγούμενης έκθεσης του δότη σε συγκεκριμένα παθογόνα, τα DLIs εμπεριέχουν παθογονο-ειδικά Τ λεμφοκύτταρα μνήμης, ικανά να θεραπεύσουν τη λοίμωξη μέσω της δράσης του μοσχεύματος έναντι λοιμώξεων [Graft vs Infection (GvI)] ωστόσο, η ευρύτερη εφαρμογή τους στη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων μετά τη μεταμόσχευση περιορίζεται λόγω της μικρής συχνότητας των αντι-ιικών Τ λεμφοκυττάρων και της υψηλής συχνότητας των αλλοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων.Η αξιοποίηση της κυτταροτοξικής δράσης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος με την υιοθετούμενη μεταφορά αντι-ιικών ή αντι-καρκινικών Τ λεμφοκυττάρων, μπορεί να βοηθήσει σημαντικά στην αντιμετώπιση των ιογενών λοιμώξεων και των υποτροπών λευχαιμίας μετά από αλλο-ΜΑΚ.Η μοναδική ικανότητα των Δενδριτικών Κυττάρων (ΔΚ) να επάγουν τη δημιουργία ειδικών ανοσοαποκρίσεων από “μη έμπειρα” (παρθένα) Τ λεμφοκύτταρα εγείρει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον ώστε να μπορέσουν να αξιοποιηθούν στην κυτταρική ανοσοθεραπεία λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, καθώς και κακοηθειών προχωρημένου σταδίου. Ωστόσο, η χαμηλή περιεκτικότητά τους στο αίμα και η περίπλοκη/δαπανηρή μεθοδολογία παραγωγής τους από τα μονοκύτταρα του αίματος, εμποδίζουν την ευρεία κλινική χρήση τους. Εναλλακτική πηγή παραγωγής ΔΚ αποτελούν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+ κύτταρα) όμως, η πρόσβαση σε πηγές CD34+ κυττάρων είναι περιορισμένη και ο αριθμός των παραγόμενων ΔΚ, σπάνια επαρκεί για κλινική εφαρμογή. Από την άλλη πλευρά, οι μη μεταμοσχεύσιμες μονάδες ομφαλιοπλακουντικού αίματος (ΜΟΠΑ) θα μπορούσαν να αποτελέσουν άμεσα διαθέσιμη, αξιοποιήσιμη πηγή CD34+ κυττάρων για παραγωγή ΔΚ.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η δυνατότητα παραγωγής μη γενετικά τροποποιημένων, ειδικών Τ λεμφοκυττάρων έναντι αντιγόνων σχετιζόμενων με τη λευχαιμία, (leukemia-specific T cells – Leuk-STs) Leuk-STs με ειδικότητα έναντι τον αντιγόνων Wilms Tumor 1 (WT1) και Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) και ακολούθως, έναντι αντιγόνων σχετιζόμενων με τη λευχαιμία και ιικών αντιγόνων ταυτόχρονα (LEukemia-VIrus specific T cells - LEVIS) LEVIS με ειδικότητα έναντι των αντιγόνων WT1, PRAME, TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) και Survivin αλλά και των ιικών αντιγόνων του κυτταρομεγαλοϊού (CMV), του ανθρώπινου αδενοϊού (AdV), του ιού EpsteinBarr (EBV) και του ιού Πολυόμα (Polyoma Virus BKV) από ΜΟΠΑ που κρίθηκαν ακατάλληλες για αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων. Αξιοποιώντας τις μη-μεταμοσχεύσιμες ΜΟΠΑ και βελτιστοποιώντας τις καλλιεργητικές συνθήκες, έγινε παραγωγή ικανού αριθμού μυελοειδών δενδριτικών κυττάρων (ΔΚ) προελεύσεως CD34+ κυττάρων ώστε να αποτελέσουν κλινική δόση. Τα παραγόμενα ΔΚ χρησιμοποιήθηκαν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα για την πραγματοποίηση πολλαπλών διεγέρσεων αυτόλογων, παρθένων Τ λεμφοκυττάρων κοινής προέλευσης ΜΟΠΑ ώστε να παραχθούν τελικά κλινικά μεταφράσιμες δόσεις πολυκλωνικών Leuk-STs και LEVIS.Τα μυελοειδή ΔΚ (CD33+/CD11c+) προελεύσεως ΜΟΠΑ, εξέφραζαν επιφανειακούς δείκτες ωρίμανσης (HLADR, CD40, CD83) υποδηλώνοντας ότι είναι ικανά να διεγείρουν επαρκώς τα Τ λεμφοκύτταρα κάτι το οποίο επιβεβαιώνεται και από τις εκκρινόμενες από αυτά κυτοκίνες ΙL12, IL6 και ΤΝFa που τα καθιστά ικανά να επάγουν την επιθυμητή Th1 ανοσοαπόκριση.Τα παραγόμενα ειδικά Τ λεμφοκύτταρα εμπεριείχαν υποπληθυσμούς CD8+ και CD4+ Τ λεμφοκυττάρων, εξέφραζαν δείκτες μνήμης και διατήρησαν πολύ χαμηλά ή μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης PD-1, CTLA4, TIM3 και LAG3 καθ’ όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας, υποδηλώνοντας ότι η παρατεταμένη έκθεση σε αντιγόνα δεν επηρέασε αρνητικά τον φαινότυπο τους και την Th-1 λειτουργικότητά τους in vitro. Επιπλέον, εμφάνιζαν ισχυρή ειδικότητα έναντι όλων των αντιγόνων-στόχων (WT1, PRAME και WT1, PRAME, TERT, Survivin, EBV,CMV,EBV,BKV, AdV) και ισχυρή κυτταροτοξική δράση in vitro.Καταληκτικά, στη διατριβή αυτή παρέχεται ένα παράδειγμα κυκλικής οικονομίας με την αξιοποίηση μη μεταμοσχεύσιμων ΟΠΑ και μια πλατφόρμα, για τη μελλοντική δημιουργία τραπεζών Leuk-STs ή/και LEVIS, ως άμεσα διαθέσιμα, «off-the-shelf» κυτταρικά προϊόντα «τρίτου χώρου», που θα αποτελούν οικονομικά αποδοτική θεραπευτική λύση για πλήθος ασθενών με ευκαιριακές λοιμώξεις που δεν αποκρίνονται στην πάγια αντι-ιική φαρμακευτική θεραπεία ή με λευχαιμίες που υποτροπιάζουν μετά από μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων.