Μελέτη των μηχανισμών μεταγραφικής ενεργοποίησης από το συνενεργοποιητή των MHC τάξης ΙΙ γονιδίων, CIITA

Abstract

During my PhD studies I worked on the mechanisms regulating the expression of Major Histocompatibility Complex class II genes. MHC class II antigens are dimeric membrane glycoproteins that recognize and present antigenic peptides to T-lymphocytes. Their expression is highly regulated in transcriptional level and their stimulation needs the existence of an enhanceosome, which is composed on highly conserved sequences (HXY) of the proximal promoter, as well as the expression of CIITA, which is the major transcriptional regulator of the MHC class II genes. CIITA can positively regulate the expression of MHC class II genes upon its recruitment through its carboxy-terminal domain onto the class II enhanceosome and with its amino-terminal domain interacting with various other transcriptional coactivators. We showed that transcriptional coactivators such as CBP, pCAF and GCN5 interact physically with CIITA in vitro and in vivo and positively regulate the expression of class II antigens. CIITA not only interacts with these coactivators but it is being acetylated in discrete lysine residues that reside in an amino-terminal nuclear localization signal. Acetylation of CIITA results in increased nuclear accumulation of the protein and enhancement of transcriptional initiation. The subcellular localization of CIITA is also affected from its self-association. Self association of CIITA results in subcellular redistribution of the protein and its functional complementation. It’s the first time, in the constraints of this study that the MHC class II enhanceosome was characterized using recombinant in vitro expressed proteins and not whole-cell extracts and it was shown the cooperative binding of all complexes onto the class II proximal promoter as well as the specificity in binding. We showed that the in vitro reconstituted enhanceosome can specifically recruit CIITA on the proximal promoter as well as other components of the basal transcription machinery. Using the technique of chromatin immunoprecipitation we showed the order of recruitment of all the factors needed for the induction of an MHC class II gene-DRA after the induction of cells with IFN-γ. It is an important result that a transcriptional transactivator such as CIITA can regulate the initiation and elongation of transcription regulating the levels of phosphorylation of specific serine residues of RNA polymerase II. This induction of DRA from IFN-γ is an inducible system of transcription that resembles the order of recruitment and induction of IFN-β gene upon virus induction, in that they both need an enhanceosome, preassembled for class II or inducible in IFN-β. Someone can take information concerning transcriptional regulation of genes in general, from the comparison of the two systems. It is more important trying to understand the transcription of class II genes and induction of expression in solid tumors where they are not normally expressed.

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήσαμε τους μηχανισμούς ρύθμισης των τάξης ΙΙ αντιγόνων του Κυρίου Συμπλόκου Ιστοσυμβατότητας. Τα τάξης ΙΙ αντιγόνα είναι διμερείς μεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες με σκοπό την παρουσίαση αντιγόνων στα Τ-λεμφοκύτταρα. Η ρύθμιση της έκφρασής τους είναι αυστηρά ρυθμιζόμενη στο μεταγραφικό επίπεδο και η επαγωγή τους απαιτεί την ύπαρξη ενός ενισχυοσώματος που δημιουργείται σε συντηρημένα στοιχεία (Η,Χ,Υ) του εγκύς υποκινητή καθώς και την έκφραση του παράγοντα CIITA, που είναι και ο κύριος μεταγραφικός ενεργοποιητής των τάξης ΙΙ γονιδίων. Το CIITA μπορεί να ρυθμίζει θετικά την έκφραση των MHC τάξης ΙΙ γονιδίων αφού με την καρβοξυτελική του περιοχή στρατολογείται στο τάξης ΙΙ ενισχυόσωμα και με την αμινοτελική του περιοχή μπορεί να αλληλεπιδρά με άλλους μεταγραφικούς συνενεργοποιητές και να επάγει τη μεταγραφή. Δείξαμε οτι οι μεταγραφικοί συνενεργοποιητές CBP, pCAF και GCN5 αλληλεπιδρούν με την αμινοτελική περιοχή του CIITA τόσο in vitro όσο και in vivo και μπορούν να ρυθμίζουν θετικά την έκφραση των τάξης ΙΙ αντιγόνων. Το CIITA όχι μόνο αλληλεπιδρά με τους παραπάνω συνενεργοποιητές αλλά ακετυλιώνεται απ’αυτούς σε διακριτά αμινοξικά κατάλοιπα λυσινών που εδράζονται σε ένα αμινοτελικό σήμα πυρηνικού εντοπισμού. Η ακετυλίωση του CIITA έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της πυρηνικής του εντόπισης και την ενδυνάμωσή του για μεταγραφική ενεργοποίηση. Η υποκυτταρική κατανομή του CIITA καθορίζεται επίσης και από γεγονότα αλληλεπίδρασής του με τον εαυτό του. Η αλληλεπίδραση του CIITA με τον εαυτό του οδηγεί σε κυτταρική ανακατανομή και λειτουργική συμπλήρωση. Ο χαρακτηρισμός του τάξης ΙΙ ενισχυοσώματος έγινε για πρώτη φορά στα πλαίσια αυτής της εργασίας χρησιμοποιώντας ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες και όχι πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και δείχθηκε η συνεργατικότητα στην πρόσδεση των συμπλόκων στον εγκύς υποκινητή καθώς και η εξειδίκευση στην πρόσδεση. Δείξαμε οτι το in vitro ανασυστημένο τάξης ΙΙ ενισχυόσωμα μπορεί να στρατολογεί ειδικά στον υποκινητή τόσο το CIITA όσο και άλλα μέρη της βασικής μεταγραφικής μηχανής. Χρησιμοποιώντας την τεχνική ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης δείξαμε την αλληλουχία στρατολόγησης των διαφόρων παραγόντων που απαιτούνται για την επαγωγή του τάξης ΙΙ DRA γονιδίου μετά την επαγωγή των κυττάρων από IFN-γ. Πολλή σημαντικό αποτέλεσμα αποτελεί η απόδειξη οτι ένας συνενεργοποιητής όπως το CIITA μπορεί να ρυθμίζει την έναρξη και επιμήκυνση της μεταγραφής ρυθμίζοντας τα επίπεδα φωσφορυλίωσης συγκεκριμένων καταλοίπων σερίνης της RNA Πολυμεράσης ΙΙ. Το σύστημα επαγωγής του γονιδίου DRA από IFN-γ είναι ένα επαγόμενο σύστημα μεταγραφής που ομοιάζει με την αλληλουχία των γεγονότων επαγωγής του γονιδίου της IFN-β μετά την προσθήκη ιού, στο ότι απαιτείται ένα ενισχυόσωμα, που στην περίπτωση των τάξης ΙΙ είναι προσχηματισμένο ενώ στην περίπτωση της IFN-β είναι επαγόμενο. Πληροφορίες που αφορούν τη μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων γενικότερα μπορεί να αντλήσει κανείς συγκρίνοντας τα δύο συστήματα. Πιο σημαντικό γεγονός κρίνεται όμως η προσπάθεια κατανόησης της μεταγραφής των τάξης ΙΙ γονιδίων και η προσπάθεια επαγωγής τους σε συμπαγείς όγκους όπου και η έκφραση ελλείπει.