Μελέτη νέων αυτοαντισωμάτων ως βιοδείκτες αυτοάνοσων νευρολογικών νοσημάτων

Abstract

Autoimmune neurological diseases are rare diseases with great heterogeneity in the clinical phenotype of patients. The use of specific biomarkers is an important tool for their diagnosis. Among the most well-studied autoimmune disorders are those induced by autoantibodies. Autoantibodies have a pathogenic role mainly when they target cell-membrane antigens such as acetylcholine receptor and MOG-glycoprotein. The present study aims to develop and use improved techniques to detect potentially pathogenic antibodies against a3 and a4 neuronal nAChR and MOG glycoprotein, specific for autoimmune neurological diseases such as autoimmune autonomic ganglionopathy (AAG), autoimmune encephalitis (AES) and myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody-associated disease (MOGAD). Neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are distinguished in many subtypes and are involved in many functions such as memory, learning, movement control and analgesia. Their loss or dysfunction is associated with many neurological and neuropsychiatric diseases. Antibodies against a3-nAChR may have pathogenic properties which cause synaptic transmission alteration in sympathetic, parasympathetic and enteric ganglia. Such antibodies have been found in patients with AAG, however low levels of antibodies against a3-nAChRs have been detected in various neurological diseases with unknown clinical and therapeutic implications. The use of the radioimmunoprecipitation assay (RIPA) is the method widely used to diagnose AAG, however its specificity is limited as approximately 50% of patients with low levels of α3-nAChR antibodies present a variety of disorders other than AAG. For this reason, we developed a cell-based assay (CBA) which specifically detects only pathogenic antibodies of AAG. The use of NACHO and RIC3 chaperones, the removal of tag sequences from the receptors (myc flag and GFP) as well as the addition of nicotine, helped to increase the expression of α3-nAChR. We studied sera from 55 patients from Greece, suspected for autonomic failure, and 13 patients from Italy, diagnosed with autonomic failure and positive for anti-α3 by RIPA. In addition, sera from 52 patients with Ca2+ channel or Hu antibodies and from 2,628 controls with various neuroimmune diseases were included. Of the 25 patients positive for anti-α3 by RIPA, 15 were positive by the CBA we developed and are also clinically confirmed to belong to AAG, while the rest had other neurological diseases. In addition, antibodies againsts α4β2-nAChR are candidate autoantigens in autoimmune encephalopathy syndrome (AES), a spectrum of neurological diseases characterized by rapid onset of mental confusion, cognitive impairment, seizures, and psychiatric symptoms. Based on the α3β2-nAChR CBA, we improved the detection method of potentially pathogenic α4β2-nAChR antibodies to identify autoantibodies in "orphan" AES cases. The study involved the screening of sera from 1752 sera of patients from Greece, Turkey and Italy who requested testing for AES and 1203 sera of 'control' patients with other neuropsychiatric diseases. 3 patients tested positive for antibodies against α4β2-nAChR. The specific clinical features of the 3 positive patients coincided with the spectrum of AES. Furthermore, in the second part of this study, we interested in MOGAD. MOGAD is an inflammatory demyelinating condition in which anti-MOG testing is an important tool in the laboratory diagnosis of the disease. However, because anti-MOG are also detected in other demyelinating diseases, it is important to have an improved CBA to avoid false-positive and false-negative results. Investigating the clinical and radiological spectrum of 21 patients positive for IgG1 anti-MOG, identified in a Greek cohort of 426 patients, "suspected" of MOGAD, and comparing the three most commonly used CBAs for the detection of anti-MOG (live IgG-CBA, live IgG1-CBA and commercial CBA), we concluded that live IgG1-CBA is superior in specificity over the others. The 21 MOG-positive patients were characterized in depth and had the clinical and radiological features associated with MOGAD.

Τα αυτοάνοσα νευρολογικά νοσήματα είναι σπάνια νοσήματα με μεγάλη ετερογένεια στον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Η χρήση ειδικών βιοδεικτών είναι σημαντικό εργαλείο στην διάγνωση των ασθενειών αυτών. Από τις πιο καλά μελετημένες αυτοάνοσες διαταραχές είναι αυτές που επάγωνται από αυτοαντισώματα. Τα αυτοαντισώματα έχουν παθογόνο ρόλο κυρίως όταν στοχεύουν σε αντιγόνα της κυτταρικής μεμβράνης, όπως είναι ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (nAChR) και η MOG γλυκοπρωτεΐνη. Η παρούσα μελέτη στοχεύει στην ανάπτυξη και χρήση βελτιωμένων τεχνικών ανίχνευσης δυνητικά παθογόνων αντισωμάτων έναντι του α3 και α4 νευρωνικού nAChR και της MOG γλυκοπρωτεΐνης, ειδικών για αυτοάνοσες νευρολογικές νόσους όπως η αυτοάνοση αυτόνομη γαγγλιονοπάθεια (AAG), η αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα (AES) και η νόσος με αντισώματα έναντι της γλυκοπρωτεΐνης της μυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOGAD). Οι νευρωνικοί nAChRs διακρίνονται σε πολλούς υπότυπους και εμπλέκονται σε πολλές λειτουργίες όπως η μνήμη, η μάθηση, ο έλεγχος της κίνησης και η αναλγησία. Η απώλεια ή δυσλειτουργία τους σχετίζεται με πολλές νευρολογικές και νευροψυχιατρικές ασθένειες. Τα αντισώματα έναντι των α3-nAChRs, μπορεί να έχουν παθογόνες ιδιότητες με αποτέλεσμα την αλλοίωση της συναπτικής μετάδοσης στο συμπαθητικό, το παρασυμπαθητικό και τα εντερικά γάγγλια. Τέτοια αντισώματα έχουν βρεθεί σε ασθενείς με AAG, ωστόσο χαμηλά επίπεδα αντισωμάτων έναντι των α3-nAChRs, ανιχνεύονται τόσο στην AAG όσο και σε διάφορα νευρολογικά νοσήματα με άγνωστες κλινικές και θεραπευτικές επιπτώσεις. Η χρήση της δοκιμασίας ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA), είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανοσολογική διάγνωση της AAG, ωστόσο η ειδικότητά της είναι περιορισμένη καθώς το 50% περίπου των ασθενών με χαμηλά επίπεδα α3- nAChR αντισωμάτων παρουσιάζουν μια ποικιλία διαταραχών εκτός της AAG. Για τον λόγο αυτό αναπτύξαμε δοκιμασία κυτταρικού ανοσοφθορισμού (CBA) με την οποία ανιχνεύονται ειδικά μόνο τα δυνητικά παθογόνα αντισώματα για την AAG. Η χρήση μοριακών συνοδών NACHO και RIC3, η αφαίρεση αλληλουχιών-ετικέτα από τους υποδοχείς (myc flag και GFP) καθώς και η προσθήκη νικοτίνης, βοήθησαν στην αύξηση της έκφρασης του α3-nAChR με αποτέλεσμα το CBA που αναπτύξαμε να ανιχνεύει τα αντισώματα έναντι των εκτεθειμένων στην επιφάνεια των κυττάρων επίτοπων με μεγάλη ευαισθησία. Μελετήσαμε ορούς 55 ασθενών από την Ελλάδα, «ύποπτους» για βλάβη στο αυτόνομο σύστημα και 13 ασθενείς από την Ιταλία, διαγνωσμένοι με αυτόνομη ανεπάρκεια και θετικοί για αντι-α3 nAChR αντισώματα με την RIPA. Επίσης ελέγχθηκαν οροί από 52 ασθενείς με αντι-VGCC ή αντι-Hu αντισώματα και 2628 ως μάρτυρες με διάφορες νευροάνοσες ασθένειες. Από τους 25 θετικούς ασθενείς για αντι-α3 nAChR αντισώματα με την RIPA, οι 15 βρέθηκαν θετικοί με το CBA που αναπτύξαμε και επιβεβαιώνονται και κλινικά ότι ανήκουν στην AAG, ενώ οι υπόλοιποι είχαν άλλες νευρολογικές ασθένειες. Επιπλέον, αντισώματα έναντι του α4β2-nAChR, είναι υποψήφια αυτοαντιγόνα στο σύνδρομο αυτοάνοσης εγκεφαλοπάθειας (AES), ένα φάσμα νευρολογικών ασθενειών που χαρακτηρίζεται από ταχεία έναρξη με ψυχικές διαταραχές, διαταραχές μνήμης και επιληπτικές κρίσεις. Βασιζόμενοι στο α3β2-nAChR CBA, βελτιώσαμε την μέθοδο ανίχνευσης των δυνητικά παθογόνων αντισωμάτων του α4β2-nAChR, για την ταυτοποίηση αυτοαντισωμάτων σε «ορφανές» περιπτώσεις AES. Ελέγξαμε 1752 ορούς ασθενών από την Ελλάδα, την Τουρκία και την Ιταλία που ζήτησαν έλεγχο για AES και 1203 ορούς ασθενών «ελέγχου» με άλλες νευροψυχιατρικές ασθένειες. 3 ασθενείς βρέθηκαν θετικοί για αντισώματα έναντι του α4β2-nAChR. Τα ειδικά κλινικά χαρακτηριστικά των 3 θετικών ασθενών συμπίπτει με το φάσμα της AES. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης αυτής, ασχοληθήκαμε με την μελέτη ανίχνευσης των αντισωμάτων κατά της MOG σε ασθενείς με απομυελινωτικά νοσήματα του κεντρικού νευρικού συστήματος, με στόχο την βελτίωση της τεχνικής ανίχνευσης τους και την εντόπιση τους μόνο σε ασθενείς που ανήκουν στην MOGAD. Η MOGAD είναι μια φλεγμονώδη απομυελινωτική νόσος στην οποία ο έλεγχος των αντι-MOG αντισωμάτων είναι ένα σημαντικό εργαλείο στην εργαστηριακή διάγνωση της. Ωστόσο, επειδή αντι-MOG αντισώματα ανιχνεύονται και σε άλλες απομυελινωτικές νόσους, είναι σημαντική η ύπαρξη ενός πολύ ειδικού και ευαίσθητου CBA για την αποφυγή ψευδώς θετικών ή αρνητικών αποτελεσμάτων. Διερευνώντας το κλινικό και ακτινολογικό φάσμα 21 ασθενών θετικών για IgG1 αντι-MOG, που εντοπίστηκαν σε μία ελληνική ομάδα 426 ασθενών, «ύποπτοι» για MOGAD, και συγκρίνοντας τα τρία πιο κοινά χρησιμοποιούμενα CBA για την ανίχνευση των αντι-MOG (live IgG-CBA, live IgG1-CBA και εμπορικό CBA), καταλήξαμε ότι το live IgG1-CBA υπερισχύει σε ειδικότητα έναντι των άλλων. Οι 21 MOG-θετικοί ασθενείς με το live IgG1-CBA χαρακτηρίστηκαν σε βάθος και είχαν τα κλινικά και ακτινολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με MOGAD.