Ανάλυση της βιοχημικής σύστασης και των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων φυσιολογικού και εκφυλισμένου ανθρώπινου μηνίσκου: συσχέτιση με τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά

Abstract

Objective: The purpose of the present study was to analyze in the normal and degenerated human menisci the orientation and changes of collagen during the stages of degeneration (low and high grade) and to correlate them with its biomechanical properties. We propose that the disorganisation of the collagen network can be measured on thin sections of meniscal tissue with the method of Raman spectroscopy and be a differential diagnosis indicator of the stages of degeneration. Design: Menisci (n= 27) were removed from human knee joints after total knee replacement or meniscectomy. For the study of the biomechanical properties under compressive load, we used the methods of nanoidentation and unconfined compression. The biomechanical measurements included the femoral and tibial surface of the meniscus and the meniscus as a whole. Following routine histopathological analysis to determine the grade of meniscal lesions obtained from healthy and degenerated formaline fixed paraffin embedded (FFPE) meniscal sections, Raman polarization approach was applied to evaluate the orientation of collagen fibrils in different levels of the same 5μm thick FFPE meniscal tissue, used for histopathological assessment. We collected Raman spectra in two different polarizations v-HH and v-VV and we calculated the mean value of the v-HH / v-VV intensity ratio of two Raman bands sensitive and non-sensitive to the molecular orientation. Results: No statistical significance of Er was observed between femoral and tibial meniscal surface, even in different stages of degeneration. Instead there were differences in Er (p=0,0027) between low (Er= 0,238±0,293 MPa) and high (Er= 0,695±0,293 MPa) degenerated menisci. We found that the collagen specific, amide I band at 1665cm−1, has the higher sensitivity dependence on the Raman polarization. The mean values of ratio v-HH/v-VV of 1665cm-1 peak intensity was significantly higher in healthy (Mean±SD: 2,56±0,46) compared to degenerated menisci (Mean±SD: 1,85±0,42) (p=0,0014). The mean values of v-HH/v-VV intensity ratio were 2,18 and 1,50 for low and high degenerated menisci respectively. (p=0,0001). The difference of peak intensities in the two laser polarizations is decreased in the degenerated meniscus; this difference is diminishing as the degeneration increases. The v-HH/v-VV ratio also desplayed significant difference in low as compared to high grade meniscus lesion, (p= 0,036 and p<0,0001 respectively) offering valuable information regarding of its biology and function. Conclusion: The orientation of collagen in the meniscal tissue is valuable information for the appreciation of its biology and function. Indeed, as the degeneration increases, the meniscal surface is not affected and maintains its functional behaviour. Instead, the menisci speciments lose their supportive role in high degeneration. This is the first study that demonstrates the biomechanical behaviour of the degenerate human meniscus under compression. In addition, we showed that the 5μm thick sections can be used for Raman analysis of meniscsal tissue with great reliability and sensitivity. Our data introduce the interesting hypothesis that compact portable Raman microscopy on tissue sections can be used intra-operatively for fast diagnosis and hence, accurate procedure design in the operating room.

Σκοπός: Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν να μελετήσει στο φυσιολογικό και στον εκφυλισμένο ανθρώπινο μηνίσκο, τον προσανατολισμό και τις μεταβολές του κολλαγόνου κατά τη διάρκεια των σταδίων της εκφύλισης (ήπια και υψηλή) και να τις συσχετίσει με την παθοεμβιομηχανική του. Η ανάλυση του υλικού μας έδειξε ότι η αποδιοργάνωση του δικτύου κολλαγόνου μπορεί να μετρηθεί πάνω σε λεπτές τομές ιστού μονιμοποιημένου σε παραφίνη πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, με τη μέθοδο της φασματοσκοπίας Raman και να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης διάγνωσης των σταδίων εκφύλισης του μηνίσκου. Υλικό και μέθοδος: Ανθρώπινοι μηνίσκοι (n= 27) αφαιρέθηκαν από αρθρώσεις γόνατος, μετά από ολική αρθροπλαστική γόνατος ή μηνισκεκτομή. Για τη μελέτη των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων κάτω από θλιπτική φόρτιση, χρησιμοποιήσαμε τις μεθοδολογίες της νανοεισχώρησης και της unconfined compression. Για τη μελέτη του προσανατολισμού του κολλαγόνου, εφαρμόσαμε την πολωμένη φασματοσκοπία Raman (PRS), χρησιμοποιώντας άβαφες λεπτές τομές υγιούς και εκφυλισμένου μηνισκικού ιστού, πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, αφού προηγουμένως είχαν επιλεγεί σημεία ενδιαφέροντος, με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου. Οι εμβιομηχανικές μετρήσεις αφορούσαν τη μηριαία και κνημιαία επιφάνεια του μηνίσκου και το μηνισκικό δοκίμιο ως σύνολο, τις περιοχές του μηνίσκου και το βαθμό εκφύλισης. Φάσματα Raman λήφθησαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές πολώσεις του laser (οριζόντια v-HH και κάθετη v-VV) και καταγράφηκε η μέση τιμή του λόγου vHH / vVV σε δύο περιοχές των φασμάτων Raman, μία ευαίσθητη και μία μη ευαίσθητη στον μοριακό προσανατολισμό. Αποτελέσματα: Με τη μέθοδο της νανοεισχώρησης, δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέτρο ελαστικότητας (Er) μεταξύ πρόσθιας, κεντρικής και οπίσθιας περιοχής του έσω και του έξω εκφυλισμένου μηνίσκου, ούτε διαφορές ανά βαθμό εκφύλισης. Με την unconfined compression, βρέθηκε σημαντικά στατιστική διαφορά στον Er μεταξύ ήπιας (Er= 0,238±0,293 MPa) και υψηλής εκφύλισης(Er= 0,695±0,293 MPa) (p=0,0027). Η ειδική για το κολλαγόνο, περιοχή του αμιδίου Ι (1665cm−1) φάνηκε να έχει τη μεγαλύτερη ευαισθησία στην πόλωση της φασματοσκοπίας Raman. Οι μέσες τιμές των εντάσεων του λόγου vHH/vVV της κορυφής 1665cm-1, μεταξύ υγιών και εκφυλισμένων μηνίσκων ήταν σημαντικά υψηλότερες στους υγιείς(Mean±SD: 2,56±0,46), σε σχέση με τους εκφυλισμένους (Mean±SD: 1,85±0,42) (p=0,0014). Η μέση τιμή του λόγου vHH/vVV ήταν 2,18 και 1,50 για της ήπιας και υψηλής εκφύλισης μηνίσκους, αντίστοιχα (p=0,0001). Η διαφορά των εντάσεων των κορυφών στις δύο πολώσεις του laser μειώνεται στον εκφυλισμένο μηνίσκο και αυτή η διαφορά ελαχιστοποιείται όσο η αυξάνει η εκφύλιση. Συγκρίνοντας τους υγιείς με τους ήπιας και υψηλής εκφύλισης μηνίσκους, υπάρχει επίσης στατιστικά σημαντική διαφορά (p= 0,036 και p<0,0001 αντίστοιχα). Συμπέρασμα: Ο προσανατολισμός του κολλαγόνου στο μηνισκικό ιστό, αποτελεί μια αξιόπιστη πληροφορία για την κατανόηση και πρόληψη της λειτουργικής συμπεριφοράς του ιστού. Καθώς η εκφύλιση αυξάνεται, η επιφάνεια των μηνίσκων δεν επηρεάζεται από την εκφύλιση, διατηρεί τη λειτουργική συμπεριφορά της, ενώ σαν σύνολο, ο μηνίσκος, χάνει τον υποστηρικτικό του ρόλο, στην υψηλή εκφύλιση. Σε αυτή την έρευνα, μελετήθηκε για πρώτη φορά η εμβιομηχανική συμπεριφορά του εκφυλισμένου ανθρώπινου μηνίσκου κάτω από θλιπτική φόρτιση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο προσανατολισμός του κολλαγόνου, όπως προσδιορίζεται από την PRS, χρησιμοποιώντας λεπτές τομές ιστού, των 5μm, πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, μπορεί να είναι διαφορικός, μεγάλης αξιοπιστίας, ευαισθησίας και ειδικότητας, διαγνωστικός δείκτης για την ανάλυση του μηνισκικού ιστού. Τα δεδομένα μας προτείνουν την ενδιαφέρουσα υπόθεση ότι ένα φορητό, εύχρηστο μικροσκόπιο Raman μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε λεπτές τομές ιστού ενδο-χειρουργικά, για γρήγορη διάγνωση και κατ’ επέκταση για το σχεδιασμό της διαδικασίας στο χειρουργείο.