Χαρτογράφηση επιτόπων νοσοειδικών αντιπυρηνικών αντισωμάτων σε ενήλικες και παιδιατρικούς ασθενείς με αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα με έμφαση στη συστηματική σκλήρυνση

Abstract

This PhD thesis has studied the epitopes of anti-Ro52 antibodies in patients with systemic sclerosis (SSc). Epitope mapping of anti-Ro52 antibodies has been extensively studied in patients with Sjögren's syndrome (SjS) and systemic lupus erythematosus (SLE). However, no comprehensive epitope mapping study has been performed in patients with systemic sclerosis (SSc), a disease where also the frequency of anti-Ro52 antibodies is increased. Five recombinant fragments of Ro52, covering the full antigen were used to test reactivity using a specifically designed line immunoassay and in house ELISA. In addition, further analysis of the results was performed based on the simultaneous presence or not of anti-Ro60 antibodies. All sera of anti-Ro52 positive patient proved reactive against the Ro52-2 fragment, whereas none against Ro52-3. Antibodies against Ro52-1 were found less frequently in patients with SSc than with SjS and/or SLE. This was also the case, to a lesser extent, against Ro52-4. A particularly interesting finding was the fact that patients with SSc and double anti-Ro52+/anti-Ro60+ reactivity showed greater reactivity against Ro52-1 than anti-Ro52+/anti-Ro60- patients. In this comprehensive analysis of the epitope mapping of Ro52 in SSc, the coiled-coil domain remains the dominant epitope in Ro52. In contrast to SjS and SLE, patients with SSc fail to recognize epitopic regions within the N-terminus of the protein, especially if they lack concomitant Ro60 reactivity. The next step was to study the presence of possible antigen-specific anti-HCMV associations with anti-Ro52 antibodies. Viral agents, such as human cytomegalovirus (HCMV), have been suggested to be the trigger for the onset of SSc. We therefore evaluated the predominant anti-HCMV antibody responses in anti-Ro52 positive and anti-Ro52 negative SSc patients, comparing them with those of SLE and SjS patients. The presence of antibodies against HCMV specific antigens pp130/UL57, pp65/UL83, pp55/UL55, pp52/UL44, p38 and pp28/UL99 was checked by immunoblotting. The main finding of this study was that patients with SSc and positive anti-Ro52 antibodies reacted more frequently against HCMV pp52/UL44 and p38 antigens compared to anti-Ro52(-), an association that was not detected in patients with SLE or SjS. Also, antibody titers against HCMV antigens pp65/UL83, pp52/UL44, and p38 were higher in anti-Ro52(+) than anti-Ro52(−) SSc patients. Therefore, antibody responses against specific HCMV antigens differ between anti-Ro52 positive and negative patients with SSc (as well as between SSc and SLE or SjS), but whether these differences are epiphenomenal remains to be determined. Finally, an epitope mapping study of the B-cell epitopes of anti-Ro52 antibodies in pediatric patients with autoimmune hepatitis (AIH) was performed. The epitope mapping study in anti-Ro52 positive pediatric patients with autoimmune hepatitis was performed using the same specific line immunoassay, mentioned above. The results of this study did not differ from the corresponding results from the epitope mapping study in adult patients with autoimmune diseases. However, the number of patients studied was small, and therefore it is important to perform similar experiments in the future in a larger number of pediatric patients with autoimmune diseases presenting with anti-Ro52 positive antibodies.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελέτησε πλήρως τους επιτόπους των anti-Ro52 αντισωμάτων σε ασθενείς με συστηματική σκλήρυνση (SSc). Η χαρτογράφηση επιτόπων των anti-Ro52 αντισωμάτων έχει μελετηθεί εκτενώς σε ασθενείς με σύνδρομο Sjögren (SjS) και συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (SLE). Ωστόσο, δεν έχει πραγματοποιηθεί καμία ολοκληρωμένη μελέτη χαρτογράφησης επιτόπων σε ασθενείς με συστηματική σκλήρυνση (SSc), όπου επίσης η συχνότητα ανίχνευσης των anti-Ro52 αντισωμάτων είναι αυξημένη. Πέντε ανασυνδυασμένα τμήματα του Ro52, που επικαλύπτουν ολόκληρο το αντιγόνο χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της αντιδραστικότητας με τη χρήση ειδικής γραμμική ανοσομεθόδου και in house ELISA. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων με βάση την ταυτόχρονη παρουσία ή όχι anti-Ro60 αντισωμάτων. Όλοι οι anti-Ro52 θετικοί οροί ασθενών αποδείχθηκαν αντιδραστικοί έναντι του τμήματος Ro52-2, ενώ κανείς έναντι του Ro52-3. Αντισώματα κατά του Ro52-1 βρέθηκαν λιγότερο συχνά σε ασθενείς με SSc από ότι με SjS ή/και SLE, καθώς επίσης σε μικρότερο βαθμό και έναντι του Ro52-4. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον εύρημα αποτέλεσε το γεγονός ότι ασθενείς με SSc και διπλή αντιδραστικότητα anti-Ro52+/anti-Ro60+ παρουσίασαν μεγαλύτερη αντιδραστικότητα έναντι του Ro52-1 σε σχέση με ασθενείς anti-Ro52+/anti-Ro60-. Σε αυτήν την περιεκτική ανάλυση της χαρτογράφησης επιτόπων του Ro52 στη SSc, η περιοχή περιελιγμένης σπείρας παραμένει ο κυρίαρχος επίτοπος στο Ro52. Σε αντίθεση με το SjS και τον SLE, οι ασθενείς με SSc αποτυγχάνουν να αναγνωρίσουν επιτοπικές περιοχές εντός του Ν-τελικού άκρου της πρωτεΐνης, ειδικά εάν δεν έχουν ταυτόχρονη αντιδραστικότητα έναντι του Ro60. Στη συνέχεια μελετήθηκε η παρουσία πιθανών αντιγονοειδικών anti-HCMV συσχετίσεων με τα anti-Ro52 αντισώματα. Ιικοί παράγοντες, όπως ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (HCMV), έχουν θεωρηθεί ότι μπορεί να αποτελέσουν το έναυσμα για την εκδήλωση SSc. Αξιολογήθηκαν συνεπώς οι κυρίαρχες anti-HCMV αντισωματικές αποκρίσεις σε θετικούς και αρνητικούς για το anti-Ro52 ασθενείς με SSc και έγινε σύγκριση αυτών με εκείνες ασθενών με SLE και SjS. Η παρουσία αντισωμάτων έναντι των ειδικών αντιγόνων του HCMV pp130/UL57, pp65/UL83, pp55/UL55, pp52/UL44, p38 και pp28/UL99 ελέγχθηκε με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης. Το κυριότερο εύρημα αυτής της μελέτης ήταν ότι οι ασθενείς με SSc και θετικά anti-Ro52 αντισώματα αντέδρασαν πιο συχνά έναντι των αντιγόνων pp52/UL44 και p38 του HCMV σε σύγκριση με τους anti-Ro52(-), συσχέτιση η οποία δεν ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με SLE ή SjS. Επίσης, οι τίτλοι αντισωμάτων έναντι των αντιγόνων του HCMV pp65/UL83, pp52/UL44 και p38 ήταν υψηλότεροι στους anti-Ro52(+) από ότι στους anti-Ro52(−) ασθενείς με SSc. Συνεπώς, οι αντισωματικές αποκρίσεις έναντι συγκεκριμένων αντιγόνων του HCMV διαφέρουν μεταξύ των anti-Ro52 θετικών και αρνητικών ασθενών με SSC (καθώς και μεταξύ SSc και SLE ή SjS), αλλά το εάν αυτές οι διαφορές είναι επιφαινόμενες μένει να εξακριβωθεί. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη χαρτογράφησης των β-κυτταρικών επιτόπων των anti-Ro52 αντισωμάτων σε παιδιατρικούς ασθενείς με αυτοάνοση ηπατίτιδα. Η μελέτη χαρτογράφησης επιτόπων σε anti-Ro52 θετικούς παιδιατρικούς ασθενείς με αυτοάνοση ηπατίτιδα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ειδικής γραμμική ανοσομεθόδου που αναφέρθηκε και παραπάνω. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δεν παρουσίασαν διαφοροποίηση σε σχέση με τα αντίστοιχα αποτελέσματα από τη μελέτη χαρτογράφησης επιτόπων στους ενήλικες ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα. Ωστόσο, ο αριθμός των ασθενών που μελετήθηκαν ήταν μικρός και επομένως κρίνεται σημαντική η μελλοντική πραγματοποίηση παρόμοιων πειραμάτων σε μεγαλύτερο αριθμό παιδιατρικών ασθενών με αυτοάνοσα νοσήματα που παρουσιάζουν anti-Ro52 θετικά αντισώματα.