Structure-based drug discovery research on the MmpL3 transporter of mycobacterium tuberculosis and the M2 proton channel of influenza A virus

Abstract

SQ109 is a tuberculosis drug candidate that has high potency against Mycobacterium tuberculosis and is thought to function at least in part by blocking cell wall biosynthesis by inhibiting the MmpL3 transporter. It also has activity against bacteria and protozoan parasites that lack MmpL3, where it can act as an uncoupler, targeting lipid membranes and Ca2+ homeostasis. Here, we showed using molecular dynamics (MD) simulations that the binding profile of nine SQ109 analogs was consistent with the X-ray structure of MmpL3 – SQ109 complex. We showed that rotation of SQ109 around carbon–carbon bond in the monoprotonated ethylenediamine unit favors two gauche conformations as minima in water and lipophilic solvent using density functional theory (DFT) calculations as well as inside the transporter’s binding area using MD simulations. Our results from MD simulations suggested that sizeable C-2 adamantyl adducts of SQ109 can fill a lipophilic region between Tyr257, Tyr646, Phe260 and Phe649 in MmpL3. This was confirmed quantitatively by our calculations of the relative binding free energies using the thermodynamic integration coupled with MD simulations method with a mean assigned error of 0.74 kcal mol−1 compared to the experimental values. We synthesized 18 analogs of SQ109 and tested them against M. smegmatis, M. tuberculosis, M. abscessus, Bacillus subtilis, and Escherichia coli, as well as against the protozoan parasites Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania donovani, L. mexicana, and Plasmodium falciparum. Activity against the mycobacteria was generally less than with SQ109 and was reduced by increasing the size of the alkyl adduct. Τwo analogs were ∼4−8-fold more active than SQ109 against M. abscessus, including a highly drug resistant strain harboring an A309P mutation in MmpL3. There was also better activity than found with SQ109 with other bacteria and protozoa. Of particular interest, we found that the adamantyl C-2 ethyl, butyl, phenyl, and benzyl analogs had 4−10× increased activity against P. falciparum asexual blood stages, together with low toxicity to a human HepG2 cell line, making them of interest as new antimalarial drug leads. We also used surface plasmon resonance (SPR) to investigate the binding of inhibitors to MmpL3 and differential scanning calorimetry to investigate binding to lipid membranes. There was no correlation between MmpL3 binding and M. tuberculosis or M. smegmatis cell activity, suggesting that MmpL3 is not a major target in mycobacteria. However, some of the more active species decreased lipid phase transition temperatures, indicating increased accumulation in membranes, which is expected to lead to enhanced uncoupler activity. The tetrameric influenza A M2 proton channel is critical for viral replication. Proton conductance of the wild type (WT) protein, with serine at position 31, is inhibited by cage alkyl amines, like amantadine, rimantadine and analogs, which bind in the channel pore. Conjugates of a cage alkyl amine with a methylene-linked aryl group have been shown to block the channel of the prevalent S31N strain with a different mechanism. Here, we investigate the binding and blocking of WT and S31N M2 (Udorn strain) by an expanded set of cage alkyl containing amines. Using a liposomal proton flux assay, we verified the channel-blocking activity of rimantadine (Rmt), its methyl analog AK59, and the tetramethyltetracyclodec-1-ylmethylamine (RL208), an isomer of amantadine for the conductance domain of WT M2 (M2CD; residues 18-60). The binding behavior of the ligands was explored using magic angle spinning NMR by recording 2D and 3D 1H-15N and 1H-13C-15N spectra of M2CD reconstituted in DPhPC lipids. Ligand binding to WT M2 was detected via chemical shift perturbation (CSP). High kinetic energy barriers associated with entry into the M2CD pore were overcome by increased temperature or a pH shift protocol which proved to be more efficient. To assess the binding mode, MD simulations were performed. Cage alkyl amines Rmt and AK59 are known to block WT M2 with their ammonium group binding to water-lined sites at Gly34 or Ala30. By contrast, MD simulations show that the conjugates with an aryl group bind outward in S31N M2CD targeting Asn31. For S31N, the His37-His37 hydrogen bonding was not disrupted according to NMR, nor was the channel blocked in the liposomal proton flux assay. Our data suggest that there is a substantial structural barrier in the amphipathic helicix (AH)-bearing CD construct, which limits entry of RL208 and aryl conjugates.

Το SQ109 είναι ένα υποψήφιο φάρμακο για τη φυματίωση που έχει υψηλή δραστικότητα κατά του Mycobacterium tuberculosis και θεωρείται ότι λειτουργεί εν μέρει μέσω της παρεμπόδισης της βιοσύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος αναστέλλοντας τον μεταφορέα MmpL3. Επίσης έχει δραστικότητα έναντι βακτηρίων και πρωτόζωων παρασίτων που στερούνται MmpL3, όπου μπορεί να δράσει ως αποζεύκτης, στοχεύοντας στις λιπιδικές μεμβράνες και την ομοιόσταση του Ca2+. Σε αυτή την δουλειά, δείξαμε χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD) ότι το προφίλ πρόσδεσης εννέα αναλόγων του SQ109 ήταν συνεπές με τη X-ray κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου MmpL3 - SQ109. Δείξαμε ότι η περιστροφή του SQ109 γύρω από τον δεσμό άνθρακα-άνθρακα στη μονοπρωτονιωμένη μονάδα αιθυλενοδιαμίνης ευνοεί δύο gauche διαμορφώσεις ως ενεργειακά ελάχιστα στο νερό ή στον λιπόφιλο διαλύτη χρησιμοποιώντας υπολογισμούς DFT καθώς και εντός της περιοχής πρόσδεσης του μεταφορέα χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Τα αποτελέσματά μας από τις προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής υπέδειξαν ότι οι ευμεγέθεις C-2 αδαμαντυλικοί υποκαταστάτες του SQ109 μπορούν να γεμίσουν μια λιπόφιλη περιοχή μεταξύ των Tyr257, Tyr646, Phe260 και Phe649 στην πρωτεΐνη MmpL3. Αυτό επιβεβαιώθηκε ποσοτικά από τους υπολογισμούς των σχετικών ελεύθερων ενεργειών δέσμευσης με τη χρήση της μεθόδου θερμοδυναμικής ολοκλήρωσης σε συνδυασμό με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (ΤΙ/MD) με ένα μέσο αποδιδόμενο σφάλμα 0,74 kcal mol-1 σε σύγκριση με τις πειραματικές τιμές. Συνθέσαμε 18 ανάλογα του SQ109 και δοκιμάσαμε την δραστικότητά τους έναντι των M. smegmatis, M. tuberculosis, M. abscessus, Bacillus subtilis και Escherichia coli, καθώς και έναντι των πρωτοζωικών παρασίτων Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania donovani, L. mexicana και Plasmodium falciparum. Η δραστικότητα έναντι των μυκοβακτηριδίων ήταν γενικά μικρότερη από ό,τι με το SQ109 και μειώθηκε με την αύξηση του μεγέθους του αλκυλικού υποκαταστάτη. Δύο ανάλογα ήταν ∼4-8 φορές πιο δραστικά από το SQ109 έναντι του M. abscessus, συμπεριλαμβανομένου ενός στελέχους με υψηλή αντοχή στα φάρμακα που έφερε μετάλλαξη A309P στην MmpL3 πρωτεΐνη. Υπήρξε επίσης καλύτερη δραστικότητα από αυτή που διαπιστώθηκε με το SQ109 σε άλλα βακτήρια και πρωτόζωα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα ανάλογα του στη C-2 θέση του αδαμαντυλίου, αιθυλ, βουτυλ, φαινυλ και βενζυλ είχαν 4-10 φορές αυξημένη δραστικότητα έναντι των άφυλων σταδίων αίματος του P. falciparum, σε συνδυασμό με χαμηλή τοξικότητα σε ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, γεγονός που τα καθιστά ενδιαφέροντα ως νέα φάρμακα οδηγούς για την καταπολέμηση της ελονοσίας. Χρησιμοποιήσαμε επίσης την μέθοδο του επιφανειακού συντονισμού πλασμονίου (surface plasmon resonance – SPR) για να διερευνήσουμε τη πρόσδεση των αναστολέων στον μεταφορέα MmpL3 και τη διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (differential scanning calorimetry – DSC) για να διερευνήσουμε την αλληλεπίδραση με λιπιδικές μεμβράνες. Δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της πρόσδεσης στον MmpL3 και της κυτταρικής δραστηριότητας στο M. tuberculosis ή M. smegmatis, γεγονός που υποδηλώνει ότι η MmpL3 πρωτεΐνη δεν αποτελεί σημαντικό στόχο στα μυκοβακτηρίδια. Ωστόσο, ορισμένα από τα πιο δραστικά ανάλογα μείωσαν τη θερμότητα μετάβασης της λιπιδικής φάσης, γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη συσσώρευση στις μεμβράνες, η οποία αναμένεται να οδηγήσει σε αυξημένη δραστικότητα των αναλόγων ως αποσυζεύκτες. Το τετραμερές κανάλι πρωτονίων της γρίπης Α M2 είναι κρίσιμο για την αντιγραφή του ιού. Η αγωγιμότητα πρωτονίων της πρωτεΐνης άγριου τύπου (WT), με σερίνη στη θέση 31, αναστέλλεται από αλκυλοαμίνες που περιέχουν αδαμαντάνιο ή άλλου τύπου κλωβό, όπως η αμανταδίνη, η ριμανταδίνη και τα ανάλογα τους, οι οποίες δεσμεύονται στον πόρο του καναλιού. Έχει αποδειχθεί ότι τα ανάλογα αυτών των παραγώγων που περιέχουν αρυλική ομάδα συνδεδεμένη με μεθυλένιο στην αμινομάδα εμποδίζουν το κανάλι του επικρατούντος στελέχους S31N με διαφορετικό μηχανισμό. Εδώ, διερευνούμε τη πρόσδεση και τον αποκλεισμό του WT και του S31N M2 καναλιού (στέλεχος Udorn) από ένα διευρυμένο σύνολο αλκυλικών αμινών που περιέχουν κλωβό. Χρησιμοποιώντας μια ανάλυση λιποσωμικής ροής πρωτονίων (liposomal proton flux assay), επαληθεύσαμε τη δραστικότητα αποκλεισμού της αγωγιμότητας του WT M2 διαύλου (M2CD - αμινοξέα 18-60) από τη ριμανταδίνη (Rmt), το μεθυλικό αναλόγο της, AK59, και ενός ισομερούς της αμανταδίνης - την τετραμεθυλοτετρακυκλοδεκ-1-υλομεθυλαμίνη, RL208. Η συμπεριφορά πρόσδεσης των προσδετών διερευνήθηκε με τη χρήση μαγικής γωνίας περιστροφής πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (magic angle spinning NMR) καταγράφοντας 2D και 3D φάσματα 1H-15N και 1H-13C-15N του M2CD διαύλου που έχει ανασυσταθεί σε DPhPC λιπίδια. Η πρόσδεση του προσδέτη στο WT M2 δίαυλο ανιχνεύθηκε μέσω διαταραχής της χημικής μετατόπισης (chemical shift perturbation - CSP). Οι φραγμοί υψηλής κινητικής ενέργειας που σχετίζονται με την είσοδο στον πόρο M2CD ξεπεράστηκαν με αύξηση της θερμοκρασίας ή με τη χρήση πρωτοκόλλου αλλαγής του pH, το οποίο αποδείχθηκε πιο αποτελεσματικό. Για την αξιολόγηση του τρόπου πρόσδεσης πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Τα ανάλογα Rmt και AK59 είναι γνωστό ότι μπλοκάρουν το WT M2 δίαυλο με την ομάδα αμμωνίου να δεσμεύει την περιοχή κοντά στη Gly34 ή Ala30 που περιβάλλονται από νερό. Αντίθετα, οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής δείχνουν ότι τα παράγωγα με την αρυλική ομάδα προσδένονται με κατεύθυνση προς τα έξω στον δίαυλο S31N M2CD στοχεύοντας την Asn31. Όσον αφορά τον δίαυλο S31N, ο δεσμός υδρογόνου His37-His37 δεν διαταράχθηκε σύμφωνα με το NMR, ούτε τα μόρια μπλόκαραν τον δίαυλος στην ανάλυση λιποσωμικής ροής πρωτονίων. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι υπάρχει ένα ουσιαστικό δομικό εμπόδιο στην δομή της Μ2CD η οποία φέρει τις αμφιπαθικές έλικες (AH), γεγονός το οποίο περιορίζει την είσοδο του αναλόγου RL208 και των αρυλικών προσδετών.