Βελτίωση των ζυμωτικών ικανοτήτων στελεχών Saccharomyces cerevisiae που χρησιμοποιούνται στην οινοποιία μέσω προσαρμοστικής εργαστηριακής εξέλιξης

Abstract

This thesis aimed at the acquisition of new Saccharomyces cerevisiae populations with improved fermentative abilities, through an innovative laboratory procedure, based on the principles of natural selection, known as Adaptive Laboratory Evolution (ALE). The already characterized strains S. cerevisiae CFB and S. cerevisiae BLR were used. The initial ALE experiment was conducted with the purpose to obtain populations more tolerant to high ethanol concentrations. Repetitive cultivations in synthetic broth with 20 g/l glucose were performed, followed by selection under strong selective pressure (1-3 h of incubation in aqueous solution with 18%, 23% or 25% v/v ethanol), repeated in a loop for 150 and 200 generations, for strains S. cerevisiae CFB and S. cerevisiae BLR, respectively. After 100 generations of evolution, the evolved CFB population survived at 25% v/v ethanol for 4 h and the evolved BLR population at 23% v/v ethanol for 2 h. Both evolved populations exhibited improved fermentative abilities in comparison with the parental strains in synthetic broth with 200 g/l glucose, completing the fermentation 166 h and 130 h earlier, respectively, while they produced maximum ethanol concentrations of 94.77 g/l and 98.67 g/l, in comparison with 84.91 g/l and 18.09 g/l of the parental strains, respectively. In actual vinification conditions with Assyrtiko and Roditis grape musts, the parental strains completed the fermentation earlier than the evolved populations of 100 generations in all cases (20 to 428 h earlier), whilst in most cases the evolved populations had higher ethanol yields. The longer fermentation time of the evolved populations was due to the time needed for the consumption of fructose of the grape must, which was in all cases extended (by 70-336 h) in comparison with the time needed for glucose consumption. Most of the volatile compounds of the wines derived from the parental strains and the evolved populations had distinct concentrations. The second ALE experiment aimed at the acquisition of ethanol tolerant S. cerevisiae populations which would simultaneously be capable of assimilating fructose more effectively. For this purpose, repetitive cultivations in synthetic broth with 20 g/l fructose were performed, followed by selection in aqueous solution with 18% v/v ethanol for 3 h, in a loop for 100 generations. In synthetic broth with 200 g/l fructose, the CFB parental strain, the CFB evolved population of 100 generations and the BLR evolved population of 100 generations left residual fructose of 54.27 g/l after 2100 h, 17.54 g/l after 2100 h and 11.99 g/l after 2000 h of incubation, respectively, whereas the BLR parental strain completed the fermentation in 400 h. In synthetic broth with 100 g/l glucose and 100 g/l fructose (grape must simulation), the CFB parental strain left 8.76 g/l and 36.31 g/l residual glucose and fructose, respectively, after 1000 h of incubation, the CFB evolved population of 150 generations on glucose completed the fermentation in 495 h and the CFB evolved population of 100 generations on fructose completed the fermentation in 170 h. The BLR parental strain, the BLR evolved population of 200 generations on glucose and the BLR evolved population of 100 generations on fructose completed the fermentation in 354 h, 312 h and 436 h, respectively. Their different fermentative behaviors were confirmed by the kinetic parameters which were estimated through fitting of the Aiba mathematical model to the experimental data. In actual vinification conditions in Assyrtiko grape must, the CFB parental strain and the CFB evolved population of 150 generations on glucose completed the fermentation in 140 h, consuming the glucose and fructose of the grape must simultaneously and the CFB evolved population of 100 generations on fructose completed it in 236 h and consumed glucose 71 h earlier than fructose. The BLR parental strain brought the grape must to dryness in 165 h, having consumed glucose 25 h earlier than fructose, the BLR evolved population of 200 generations on glucose brought it to dryness in 380 h, having consumed glucose 144 h earlier than fructose and the BLR evolved population of 100 generations on fructose consumed both sugars in 236 h, having consumed glucose 50 h earlier than fructose. Statistically important differences among the different produced wines were detected in seven alcohols, five esters and five acids. Those differences were partially confirmed by the sensory analysis of the wines. The present thesis aspires to conduce to further implementation of laboratory evolution (ALE) experiments both in the bioethanol industry and in the winemaking industry, with the purpose to obtain new yeast strains with improved qualities.

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών Saccharomyces cerevisiae με βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες, μέσω μιας καινοτόμου εργαστηριακής τεχνικής, βασιζόμενης στις αρχές της φυσικής επιλογής, της Προσαρμοστικής Εργαστηριακής Εξέλιξης (Adaptive Laboratory Evolution- ALE). Χρησιμοποιήθηκαν τα χαρακτηρισμένα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR. Το πρώτο πείραμα ALE διενεργήθηκε με σκοπό την απόκτηση κυτταρικών πληθυσμών ανθεκτικότερων (σε σχέση με τα άγρια στελέχη) σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες των κυττάρων σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 20 g/l γλυκόζη ακολουθούμενες από επιλογή υπό αυστηρή εξελικτική πίεση (1-3 h επώασης σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18%, 23% ή 25% v/v αιθανόλης), κυκλικά για 150 και 200 γενεές, για τα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR, αντίστοιχα. Κατόπιν 100 γενεών εξέλιξης, ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB επιβίωσε σε 25% v/v αιθανόλη για 4 h και ο εξελιγμένος πληθυσμός BLR σε 23% v/v αιθανόλη για 2 h. Και οι δύο εξελιγμένοι πληθυσμοί επέδειξαν βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες σε σύγκριση με τα άγρια στελέχη σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l γλυκόζη, περατώνοντας τη ζύμωση 166 h και 130 h νωρίτερα, αντίστοιχα, ενώ παρήγαγαν μέγιστες συγκεντρώσεις αιθανόλης 94,77 g/l και 98,67 g/l, σε σύγκριση με 84,91 g/l και 78,09 g/l των αγρίων στελεχών, αντίστοιχα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκη Ασύρτικου και Ροδίτη, τα άγρια στελέχη σε όλες τις περιπτώσεις ολοκλήρωσαν τη ζύμωση νωρίτερα από τους πληθυσμούς 100 γενεών εξέλιξης (20 h έως 428 h νωρίτερα), ενώ οι εξελιγμένοι πληθυσμοί στην πλειονότητα των περιπτώσεων είχαν μεγαλύτερη απόδοση σε αιθανόλη. Ο αυξημένος χρόνος ζύμωσης των εξελιγμένων πληθυσμών οφειλόταν στο χρόνο κατανάλωσης της φρουκτόζης του γλεύκους, ο οποίος ήταν σε όλες τις περιπτώσεις πολύ μεγαλύτερος (κατά 70-336 h) του χρόνου αφομοίωσης της γλυκόζης. Οι συγκεντρώσεις των περισσοτέρων πτητικών ενώσεων των οίνων οι οποίοι προέκυψαν από τα άγρια στελέχη και τους εξελιγμένους κυτταρικούς πληθυσμούς ήταν διαφορετικές μεταξύ τους.Το δεύτερο πείραμα ALE είχε ως στόχο την απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών S. cerevisiae, ανθεκτικότερων στην αιθανόλη, οι οποίοι ταυτοχρόνως θα έχουν τη δυνατότητα να αφομοιώνουν αποτελεσματικότερα τη φρουκτόζη. Για την υλοποίηση αυτού του στόχου πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες σε θρεπτικό υλικό με 20 g/l φρουκτόζη, ακολουθούμενες από επιλογή για 3 h σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18% v/v αιθανόλης, κυκλικά για 100 γενεές. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l φρουκτόζη, το άγριο στέλεχος CFB, ο πληθυσμός CFB 100 γενεών εξέλιξης και ο πληθυσμός BLR 100 γενεών εξέλιξης άφησαν αζύμωτες ποσότητες φρουκτόζης 54,27 g/l μετά από 2100 h επώασης, 17,54 g/l μετά από 2100 h επώασης και 11,99 g/l μετά από 2000 h επώασης, αντίστοιχα, ενώ το άγριο στέλεχος BLR περάτωσε τη ζύμωση σε 400 h. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 100 g/l γλυκόζη και 100 g/l φρουκτόζη (προσομοίωση γλεύκους) το άγριο στέλεχος CFB άφησε αζύμωτες ποσότητες γλυκόζης και φρουκτόζης 8,76 g/l και 36,31 g/l, αντίστοιχα μετά από 1000 h επώασης, ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 150 γενεές σε γλυκόζη ολοκλήρωσε τη ζύμωση σε 495 h και ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 170 h. Το άγριο στέλεχος BLR, ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 200 γενεές σε γλυκόζη και ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη περάτωσαν τη ζύμωση σε 354 h, 312 h και 436 h, αντίστοιχα. Οι διαφορετικές ζυμωτικές συμπεριφορές επιβεβαιώθηκαν από τις κινητικές παραμέτρους που ελήφθησαν μετά από προσαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Aiba στα πειραματικά δεδομένα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκος Ασύρτικου, το άγριο στέλεχος CFB και ο εξελιγμένος πληθυσμός 150 γενεών σε γλυκόζη, ολοκλήρωσαν τη ζύμωση σε 140 h, καταναλώνοντας ταυτόχρονα τη γλυκόζη και τη φρουκτόζη του γλεύκους και ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB 100 γενεών σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 236 h και κατανάλωσε τη γλυκόζη 71 h νωρίτερα από τη φρουκτόζη. Το άγριο στέλεχος BLR οδήγησε το γλεύκος σε πλήρη ξηρότητα στις 165 h, έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 25 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη, ο εξελιγμένος πληθυσμός 200 γενεών σε γλυκόζη το οδήγησε σε πλήρη ξηρότητα σε 380 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 144 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη και ο πληθυσμός εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη κατανάλωσε και τα δύο σάκχαρα σε 236 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 50 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών παραχθέντων οίνων παρατηρήθηκαν σε επτά αλκοόλες, πέντε εστέρες και πέντε οξέα. Οι εν λόγω διαφορές επιβεβαιώθηκαν μερικώς από τον οργανοληπτικό έλεγχο των οίνων.Η παρούσα διδακτορική διατριβή φιλοδοξεί να συμβάλει στην ευρύτερη εφαρμογή της εργαστηριακής εξέλιξης (ALE) τόσο στη βιομηχανία παραγωγής βιοαιθανόλης, όσο και στην οινοποιία, με στόχο την απόκτηση νέων στελεχών ζυμομυκήτων με βελτιωμένες ιδιότητες.