DNA replication dyregulation and response pathways following induced genotoxic stress in Schizosaccharomyces pombe

Abstract

Eukaryotic sizable genomes start their replication by simultaneous activation of multiple, dispersed origins, which fire stochastically during the S phase. Initiation of DNA replication from each origin is a two-step process, which involves loading of the MCM replicative helicases in an inactive state (licensing) and activation of the helicase at a later step (firing). Licensing of DNA replication is pivotal for ensuring that each origin will fire only once during the S phase of the cell cycle, providing a molecular memory for which origins have been activated, and thus should not be re-activated until the next cell cycle, and which not. CDC6/Cdc18 and Cdt1 are the two evolutionarily conserved from yeast to mammals licensing factors that load the MCM2-7 complexes onto the DNA forming the pre-Replicative complexes, that will be activated towards the G1/S transition due to CDK activity increase. The significance of the licensing process for maintenance of genome stability is evident, since its deregulation is accompanied by profound DNA damage, genetic instability, and loss of viability, thus being considered as a source of genotoxic stress. In fission yeast, Cdc18 overexpression is sufficient to overcome the ‘only once per cell cycle’ origin licensing rule and induces re-replication, the generation of replicative bubbles within bubbles, which is known to cause fork collision and DNA breakage. In humans, CDC6/CDT1 overexpression has been reported in pre-malignant cells, highlighting their role as oncogenes. This thesis was dedicated to investigating cellular/molecular mechanisms that may have evolved to early sense aberrations in the licensing system, promoting early responses to safeguard genome stability. To this end, we focused on the ribosomal DNA, an evolutionarily conserved genomic locus with multiple, densely spaced origins of replication. We speculated that this locus, due to several innate characteristics with most prominent the accumulation of many origins in a defined space, would be extra-sensitive in re-replication events. We set out to assess this hypothesis by utilizing the model organism fission yeast as an experimental system. Our data show that the rDNA copy number gets destabilized from an early timepoint upon induction of Cdc18 overexpression, before an established amplification hotspot gets increased. Moreover, the nucleolus organized around the rDNA accumulates phospho-H2A and Rad22 foci, two-established DSB markers even when mild re-replication is induced. In the second part of this thesis, we analyzed checkpoint controls elicited by Cdc18 overexpression. By combining experiments with wt Cdc18/N-terminally truncated Cdc18 in a rad3+/rad3Δ background, we show that Rad3-independent and Rad3-dependent pathways, initiated by Cdc18 O/E, act in synergy to achieve robust mitotic block even under mild re-replication, hence outlining Cdc18 as a master protector of genome integrity.

Τα ευμεγέθη ευκαρυωτικά γονιδιώματα εκκινούν την αντιγραφή τους από πολλές διαφορετικές, διάσπαρτες σε αυτά αφετηρίες, που ενεργοποιούνται με στοχαστικότητα κατά τη διάρκεια της φάσης S. Η διαδικασία εκκίνησης της αντιγραφής από κάθε αφετηρία είναι μία διαδικασία δύο σταδίων. Αρχικά, λαμβάνει χώρα αδειοδότηση της αφετηρίας κατά την οποία η ελικάση της αντιγραφής MCM2-7 φορτώνεται στην αφετηρία από τους αδειοδοτικούς παράγοντες CDC6/Cdc18 και Cdt1 σε αδρανή κατάσταση. Στο δεύτερο στάδιο, η ελικάση ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση λόγω της αύξησης της CDK δραστηριότητας κατά τη G1/S μετάβαση, η οποία σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση και άλλων βοηθητικών παραγόντων και τη στρατολόγηση της αντιγραφικής μηχανής πυροδοτεί το τοπικό ξετύλιγμα του DNA και τη σύνθεση του νέο-αντιγραφόμενου DNA. Απορρύθμιση του μηχανισμού αδειοδότησης της αντιγραφής σχετίζεται με γονιδιωματική αστάθεια και με την επαγωγή μονοπατιών κυτταρικού θανάτου. Στο σχιζοσακχαρομύκητα υπερέκφραση του αδειοδοτικού παράγοντα Cdc18 αρκεί για την κατάργηση του κανόνα για εκκίνηση της αντιγραφής μία και μόνο μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, προκαλώντας επαναντιγραφή του DNA κατά την οποία αντιγραφικές φυσαλίδες γεννώνται μέσα σε ήδη υπάρχουσες φυσαλίδες. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής υπήρξε η διερεύνηση κυτταρικών «αισθητήρων» ειδικά για φαινόμενα απορρύθμισης του αδειοδοτικού μηχανισμού. Για το σκοπό αυτό διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος του ριβοσωματικού DNA (ribosomal DNA, rDNA) ως αισθητήρα βλαβών ειδικά κατά την επαγωγή του φαινομένου της επαναντιγραφής. Το ριβοσωματικό DNA αποτελείται από εκατοντάδες-χιλιάδες επαναλήψεις rRNA γονιδίων, η μεταγραφή των οποίων δίνει γένεση στον πυρηνίσκο. Σε κάθε επανάληψη εδράζεται μία αφετηρία της αντιγραφής με αποτέλεσμα τη συσσώρευση πολλών θέσεων έναρξης της αντιγραφής που βρίσκονται σε πυκνή διάταξη στο rDNA. Δεδομένης της ιδιαιτερότητας του rDNA ως προς τη συσσώρευση αφετηριών αλλά και άλλων εγγενών χαρακτηριστικών (συνεχής και έντονη μεταγραφή των γονιδίων του, περιοχές φραγμού της αντιγραφικής διχάλας, τεταρτογενείς δομές του DNA G4 κ.ά.) υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο σε συνθήκες επαναδειοδότησης και επαναντιγραφής, δρώντας ως σηματοδότης της ύπαρξης ανισορροπίας στο σύστημα αδειοδότησης. Αξιοποιήσαμε το σχιζοσακχαρομύκητα ως πειραματικό σύστημα προκειμένου να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το rDNA εμφανίζει αύξηση του αριθμού αντιγράφων του πολύ νωρίς κατά την πρόκληση ήπιας επαναντιγραφής. Ακόμη, εστίες συσσώρευσης των δεικτών DNA βλάβης της φωσφορυλιωμένης ιστόνης 2Α και του Rad22 συγκεντρώνονται κυρίως στην περιοχή του πυρηνίσκου, που οργανώνεται γύρω από το rDNA, κατά την επαγωγή ήπιας επαναντιγραφής. Στο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής πραγματοποιήσαμε συνδυαστικά πειράματα με υπερέκφραση Cdc18 αγρίου τύπου ή μεταλλάγματος από το οποίο απουσιάζει το αμινοτελικό άκρο παρουσία ή απουσία της πρωτεΐνης Rad3, δείχνοντας ότι κατά την υπερέκφραση του Cdc18 τα επαγόμενα Rad3-εξαρτώμενα και μη μονοπάτια είναι αναγκαίο να δρουν σε συνέργεια για την πλήρη παρεμπόδιση της εισόδου σε μίτωση όταν το DNA των κυττάρων έχει υποστεί επαναντιγραφή. Έτσι, το Cdc18 αναδεικνύεται ως κομβικό μόριο για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.