Studying the integrated stress response in tumor progression and drug resistance

Abstract

Tumor growth and metastasis involve a complex relationship with the tissue microenvironment. A proliferating tumor encounters multiple stresses from the microenvironment like hypoxia, lack of nutrients and acidosis. To cope with these conditions, cancer cells can co-opt existing cytoprotective mechanisms, such as the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR involves transcriptional and translational activation of signaling pathways designed to relieve cellular stress and attenuate cell death; although, in the case of unresolved or acute ER stress, UPR can promote cell death. However, the mechanisms by which the UPR influences cell fate in the presence of ER stress are poorly understood. To address this, we have used a functional CRISPR-based genetic knockout screen, to determine novel regulators of UPR and the mechanisms involved to control cellular fate following chronic ER stress. We delivered a lentiviral genome-wide CRISPR-Cas9 knockout library to two cell lines and identified sgRNAs which are over-represented (pro-apoptotic genes), or underrepresented (pro-survival genes) following ER stress induced by thapsigargin and tunicamycin. One of the highest-ranking gene candidates was Survivin/BIRC5, a protein which is overexpressed in tumor cells compared to normal tissues. Survivin can act as an inhibitor of apoptosis; however, its primary function is to promote proper regulation of mitosis and cytokinesis as part of the Chromosomal Passenger Complex. Our results show that genetic knockdown or chemical inhibition of Survivin leads to sensitization to ER stress and causes formation of micronuclei and multinucleated cells due to failure of cytokinesis. Intriguingly, Survivin-deficient cells also have an expanded ER and activate the UPR. We hypothesize that these cells have significantly increased DNA content which imposes higher transcriptional and translational demands, thereby causing ER expansion in order to support them. This, in turn, creates a reliance of these cells on a functioning UPR, whose inhibition results in cell death. PERK arm of the UPR acts in protective way, helping the cell to survive after the ER stress induced by Survivin ablation. Our results demonstrate that polyploidy, and generally, genomic instability represent cellular stresses during which a hyperactive UPR may be required, thereby revealing new vulnerabilities for therapeutic intervention in malignancy.

Ο πολλαπλασιασμός και η ανάπτυξη ενός όγκου καθώς και η μετάσταση σε άλλους ιστούς βασίζονται σε μία σύνθετη σχέση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του μικροπεριβάλλοντος. Ένας αναπτυσσόμενος όγκος αντιμετωπίζει ποικίλα είδη στρες που προέρχονται από το μικροπεριβάλλον, όπως υποξία, έλλειψη θρεπτικών συστατικών και οξείδωση. Για να αντιμετωπίσουν αυτά τα στρεσογόνα ερεθίσματα και συνθήκες, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να οικειοποιηθούν φυσιολογικούς κυτταροπροστατευτικούς μηχανισμούς, όπως το μονοπάτι Απόκρισης στις Μη-Αναδιπλωμένες Πρωτεΐνες (AMAΠ). Το ΑΜΑΠ περιλαμβάνει την μεταγραφική και μεταφραστική ενεργοποίηση άλλων μονοπατιών που στοχεύουν να καταπραΰνουν το στρες και να αναστείλουν τον κυτταρικό θάνατο όταν οι στρεσογόνοι παράγοντες είναι οξείς και μικρής διαρκείας. Αντίθετα, όταν το στρες είναι χρόνιο και έχει ισχυρές επιπτώσεις στο κύτταρο τότε το ΑΜΑΠ θα στραφεί προς την ενεργοποίηση προαποπτωτικών μηχανισμών με σκοπό να οδηγήσει το κύτταρο σε θάνατο. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στο αν το ΑΜΑΠ θα έχει προστατευτικό ή προαποπτωτικό ρόλο δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Για το σκοπό αυτό, η παρούσα ερευνητική εργασία στοχεύευει στην ταυτοποίηση νεών μορίων που ρυθμίζουν τους μηχανισμούς απόκρισης στο στρες του ενδοπλασματικού δικτύου (ΣΕΔ) και καθορίζουν την έκβαση των κυτταρικών αποκρίσεων χρησιμοποιώντας σε επίπεδό γονιδιώματος μια λειτουργική λεντΐική «βιβλιοθήκη» CRISPR/Cas9 (functional CRISPR-based genetic knockout screen). Πιο συγκεκριμένα, δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές διαμολύνθηκαν με την βιβλιοθήκη ώστε από κάθε κύτταρο να αποσιωπηθεί η έκφραση ενός γονιδίου. Τα κύτταρα αυτά υποβλήθηκαν σε στρες του ενδοπλασματικού δικτύου και αυτά που επιβίωσαν χρησιμποποιήθηκαν για την ταυτοποίηση μικρών RNA-οδηγών (small guide RNAs-sgRNAs) που είναι συγκεκριμένα για κάθε γονιδιακό τόπο και οδηγούν το ένζυμο Cas9 να «κόψει» το DNA σε αυτό το σημείο. Αν ένα sgRNA αντιπροσωπεύεται στον τελικό κυτταρικό πληθυσμό σε μεγάλο αριθμό τότε το γονίδιο στο οποίο αντιστοιχεί είναι προαποπτωτικό, διότι τα κύτταρα στα οποία είχε απενεργοποιηθεί επιβίωσαν αντί να πεθάνουν. Αντίστοιχα, αν ένα γονίδιο έχει μικρό αριθμό αντιπροσωπευτικών sgRNA τότε έχει ρόλο προστατευτικό. Ένας από από τους πιο ενδιαφέροντες ρυθμιστές στην αρνητική κλίμακα κατάταξης με πιθανό προστατευτικό ρόλο έναντι του ΣΕΔ ήταν η Survivin (BIRC5), η οποία εκφράζεται μόνο στα καρκινικά κύτταρα και έχει χαρακτηριστεί αρχικά ως αναστολέας της απόπτωσης. Ωστόσο, ο βασικός της ρόλος είναι η οργάνωση της μιτωτικής ατράκτου και η προαγωγή του κυτταρικού κύκλου. Η παρούσα ερευνητική εργασία κατέδειξε ότι η γενετική ή χημική αναστολή της έκφρασης της Survivin προκαλεί ευαισθησία στο ΣΕΔ, και οδηγεί στο σχηματισμό κυττάρων με εκτεταμένο ΕΔ και πολλαπλούς πυρήνες. Επιπλέον, η αναστολή της Survivin προκαλεί ΣΕΔ και συνεπαγόμενη ενεργοποίηση του UPR, το οποίο φέρεται να έχει προστατευτικό ρόλο έναντι στο στρες προκλινόμενο από την αναστολή της. Η υπόθεση μας βασίζεται στο ότι τα κύτταρα αυτά προβαίνουν σε λανθασμένη κυτταροκίνηση που οδηγει σε κύτταρα με ανευπλοειδία. Τα προκύπτοντα κύτταρα έχουν περισσότερο DNA, συνεπώς περισσότερες μεταγραφικές και μεταφραστικές απαιτήσεις και επεκτείνουν το ΕΔ για να ανταπεξέλθουν σε αυτές. Το ΑΜΑΠ ενεργοποιείται ώστε να συμβάλει στη μείωση του στρες και την επιβίωση του κυττάρου. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η πολυπλοειδία και γενικότερα η γενετική αστάθεια αποτελούν από μόνα τους κυτταρικούς στρεσογόνους παράγοντες του ΕΔ για την αντιμετώπιση των οποίων απαιτείται η πορεία UPR. Παράλληλα, αναδεικνύονται νέες αδυναμίες των καρκινικών κυττάρων και πιθανοί στόχοι για το σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων που αποσκοπούν στην αποσιώπιση της έκφρασης της Survivin και την παράλληλη αναστολή της πορείας ενεργοποίησης της ΣΕΔ.