Εξερεύνηση καινοφανών μηχανισμών Delta-Notch σηματοδότησης που παρακάμπτουν την ουβικουιτυλίωση

Abstract

Notch signalling pathway is an intercellular communication system, that controls many aspects of development requiring cell to cell physical contact. The transmembrane Notch receptor needs to engage in trans (from adjacent cells), with its ligands, the DSL proteins. The two members of the family in D. melanogaster, Delta and Serrate are reported to be activated by two E3 RING type Ubiquitin ligases, namely Neuralized and Mindbomb 1, which mediate ubiquitylation of their intracellular domain (icd). It is well established that membrane protein mono- or (better) poly-ubiquitylation contributes to their endocytosis. Hence, it has been long proposed that Dl’s and Ser’s modification by Ubi stimulates their activity by promoting their endocytosis, even though the mechanistic details are unknown. It is perceived that DSL protein endocytosis generates the adequate mechanical force, necessary for the conformational change inside the Notch NRR domain, allowing for initiation of a cascade of proteolytic cleavages, which result in disengagement of Notch intracellular domain from the plasma membrane and its delivery to the nucleus, now free to turn on its target genes. Besides the two E3 Ub ligases, two other endocytic molecules have been implicated in DSL activation, dynamin and epsin. Dynamin is a GTPase and plays an important role in the fission of coated pits from the plasma membrane, by constricting their neck using GTP hydrolysis. Epsin is an endocytic adaptor protein which recognizes ubiquitylated cargo (membrane proteins) with its UIMs (Ubiquitin Interacting Motifs) and connects them with clathrin, thereby initiating membrane protein cargo internalization via clathrin mediated endocytosis. In Drosophila, dynamin is required for all Notch activities, and epsin as well shows almost complete requirement. On the contrary, Neur and Mib1 seem to have complementary functions: depending on the context, one of them is sufficient for ligand activation. Actually MIB1 in mammals seems to have the primary role in Notch dependent processes, whereas Neur has evolved several new unrelated functions. In this study we examined whether Neur and Mib1 share a common activation mechanism on Delta. We used a large variety of Delta and Neur variants, and tested them in the in vivo context of Neuroblast lineages of Drosophila CNS. We showed that Mib1 requires the presence of Delta’s intracellular lysines. More interestingly, Neur’s action is diversified by acting without lysines: Dl-Neur interaction per se, is more important than ubiquitylation and it is able to give basal levels of activity. Nevertheless, this basal activity was significantly increased when Ubi addition onto any of the lysines (K) of the Dl-Neur complex was enabled. These results, taken together with the fact that dynamin is required (but epsin is not) in this cellular process, suggest that Neur acts as Dl’s endocytic adaptor, and that that the Dl-Neur complex is more active when ubiquitin molecules are added on Dlicd or somewhere else. A similar mode of action seems to be at play, in another Neur dependent Notch signalling event, the generation of NB by lateral inhibition during embryogenesis. In addition, we tried to reconstitute the functional interaction of Delta with both ligases in tissue culture experiments. Initially we confirmed that both of them can ubiquitylate Delta, when Delta’s icd lysines are present. We tried to identify novel Dl interactors by mass spectrometry, but our effort was not fruitful in the end.

Η σηματοδότηση Notch είναι ένας τύπος διακυτταρικής επικοινωνίας που συμμετέχει σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες και προϋποθέτει τη διακυτταρική επαφή, καθώς ο διαμεμβρανικός υποδοχέας Notch πρέπει να αλληλεπιδράσει με τους επίσης διαμεμβρανικούς προσδέτες του, τις DSL πρωτεΐνες. Στη Δροσόφιλα, τα μέλη της οικογένειας DSL πρωτεινών είναι η Delta (Dl) και η Serrate (Ser) και ενεργοποιούνται από δύο Ε3 λιγάσες ουβικουιτίνης τύπου RING, τη Neuralized (Neur) και την Mindbomb1 (Mib1) που μπορούν να καταλύσουν την ουβικουιτυλίωση των ενδοκυττάριων περιοχών τους. Γενικότερα, είναι καλά εδραιωμένο το γεγονός ότι η μόνο-ουβικουιτυλίωση και (καλύτερα) η πολύ- ουβικουιτυλίωση των μεμβρανικών πρωτεϊνών συνεισφέρει στη ενδοκύττωση τους. Γι αυτό έχει προταθεί ότι η Ubi τροποποίηση των Dl, Ser μεταφράζεται σε ενεργοποίηση της σηματοδότησης μέσω ενδοκύττωσης, αν και οι μηχανιστικές λεπτομέρειες δεν είναι γνωστές. Θεωρείται ότι η ενδοκύττωση των DSL πρωτεϊνών παρέχει την απαραίτητη δύναμη για να αλλάξει η στερεοδιαμόρφωση της NRR επικράτειας του trans προσδεμένου μορίου Notch (trans=από το γειτονικό κύτταρο), οδηγώντας σε καταρράκτη ενεργοποιητικών πρωτεολύσεων, που τελικά απελευθερώνουν το Notch ενδοκυττάριο τμήμα στον πυρήνα, που μπορεί πλέον να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων του. Πέραν των δύο λιγασών ουβικουιτίνης, δύο άλλα ενδοκυττωτικά μόρια έχουν υπονοηθεί στη λειτουργία των DSL προσδετών, η δυναμίνη και η εψίνη. Η δυναμίνη είναι μια GTPάση που παίζει καίριο ρόλο στην απόσχιση των ενδοκυττωτικών βοθρίων από την πλασματική μεμβράνη, περισφίγγοντας το λαιμό τους. Η εψίνη είναι ένα από τα μόρια-προσαρμογείς μεταξύ μεμβρανικών φορτίων και της κλαθρίνης, που εκτελεί τα βήματα της ενδοκύττωσης στην πλασματική μεμβράνη. Η ιδιαιτερότητα της εψίνης είναι ότι διαθέτει μοτίβα αλληλεπίδρασης με ουβικουιτίνη. Στη Δροσόφιλα η δυναμίνη απαιτείται σε όλες τις διεργασίες όπου εμπλέκεται το Notch και η εψίνη σε σχεδόν όλες. Αντίθετα, η δράση των Neur και Mib1 φαίνεται να είναι διαζευκτική: μία από τις δύο αρκεί για να ενεργοποιήσει τους DSL προσδέτες, ανάλογα με την περίσταση. Μάλιστα στα θηλαστικά η Mib1 φαίνεται να έχει πάρει πρωτεύοντα ρόλο, με τα ομόλογα της Neur να δείχνουν ελάχιστη συσχέτιση με Notch-εξαρτώμενες διαδικασίες.Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε αν οι Mib1 και Neur έχουν τον ίδιο μηχανισμό δράσης πάνω στον προσδέτη Delta. Αξιοποιήσαμε μία μεγάλη γκάμα από Delta και Neur παραλλαγές, που τις εξετάσαμε in vivo στο πλαίσιο των γενεαλογιών των βλαστοκυττάρων του ΚΝΣ. Δείξαμε ότι η Mib1 απαιτεί την παρουσία των ενδοκυττάριων λυσινών του Delta για να παράγει σήμα. Αντίθετα, η Neur δρα και χωρίς λυσίνες: η αλληλεπίδραση Delta-Neur αυτή καθαυτή είναι πιο σημαντική από την ουβικουιτυλίωση και από μόνη της δίνει χαμηλά επίπεδα σηματοδότησης. Όμως, η προσθήκη μορίων ουβικουιτίνης σε διαφορετικά σημεία του Delta-Neur συμπλόκου ενισχύει σημαντικά αυτή τη σηματοδότηση. Τα αποτελέσματά αυτά, συνεκτιμώμενα με το γεγονός ότι η δυναμίνη χρειάζεται για τη συγκεκριμένη διαδικασία (ενώ η εψίνη όχι), προτείνουν ότι η Neur δρα σαν ενδοκυττωτικός προσαρμογέας της Delta και το Dl-Neur σύμπλοκο είναι πιο ενεργό όταν τροποποιείται από ουβικουιτίνες, είτε αυτές προστίθενται στο Dl είτε κάπου αλλού. Ένας παρόμοιος μηχανισμός φαίνεται να τίθεται σε λειτουργία σε μία άλλη Neur εξαρτώμενη Notch διαδικασία, τη γένεση των ΝΒ στο έμβρυο, μέσω πλευρικής αναστολής. Προσπαθήσαμε να ανασυστήσουμε τη λειτουργική αλληλεπίδραση Delta και των δύο λιγασών σε κυτταροκαλλιέργειες. Αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι και οι δύο λιγάσες μπορούν να ουβικουιτυλιώσουν το Delta, εφόσον οι ενδοκυττάριες λυσίνες του είναι άθικτες. Όμως η προσπάθειά μας να ταυτοποιήσουμε αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες του Delta μέσω φασματομετρίας μάζας δεν απέδωσε καρπούς.