Μελέτη της επίδραση της έξωνεφρικής κάθαρσης σε υποπληθυσμούς των Τ- λεμφοκυττάρων διαβητικών και μη διαβητικών ασθενών με χρόνια νεφρική νόσο τελικού σταδίου και συσχέτιση με αρτηριοσκληρυντικές αγγειακές αλλοιώσεις

Abstract

Chronic kidney disease (CKD) is assosiated with immune deficiency. Immune system alterations involve both innate and acquired immunity. Progressive loss of renal function and accumulation of uremic toxins lead to a preferential loss of lymphoid cells, while myeloid cells remain almost untouched. Regarding T cell immunity CKD leads to a decrease in number and function of several T lymphocyte subsets, especially affecting naïve and memory subpopulations. These alterations resemble those observed during ageing or chronic inflammatory conditions. More specifically, there is a preferential loss of CD28 expression in CKD, which increases susceptibility to activation induced apoptosis in both CD4 and CD8 T cells. This phenomenon has been associated with chronic inflammation that accompanies CKD, however, it may also be subsequent to subclinical CMV re-activation in these patients. Interestingly, CD28- T lymphocytes appear to be highly differenciated cells, and as recent evidence suggest, they play a significant role in chronic inflammatory conditions including atherosclerosis. As a consequence of aquired immune alterations, CKD patients are highly susceptible to infections and respond poorly to vaccination. Furthermore, they are at an increased risk of developing atherosclerotic cardiac disease. T lymphocyte alterations, such as a decrease in regulatory T cells and an increase in CD4CD28null T cells have long been recognised as contributing to accelerated atherosclerosis and cardiovascular disease; the main cause of death in the CKD population. Activated CD4 T lymphocytes, Natural Killer (NK) cells and macrophages are the basic components of the atheromatous plaque as originally shown in animal models of atherogenesis. In addition, during the last two decades CD4CD28null T cells were associated with acute coronary events and have been suggested as a biomarker and potential therapeutic target in CVD. Recent studies advocate that increased morbidity and mortality in chronic kidney disease patients may be a direct consquence of the chronic subclinical inflammatory state, which leads to alterations in both innate and acquired immunity. Data from recent studies compairing T cell alterations in pre-dialysis and dialysis state are scarce and conflicting. Some investigators have reported further alterations in patients immunological profile after initiation of dialysis, while others found no difference between pre dialysis and dialysis state. The present prospective longitudinal study aimed to investigate T cell alterations in ESRD patients in pre-dialysis state compaired to age and gender mached healthy volunteers. Additionally the effect of different dialysis methods (hemodialysis, peritoneal dialysis) was also assessed regarding T cell alterations. More specifically, CD4+, CD8+, CD4+CD28null and CD8+CD28null and CD4+CD25+ T-cells were analyzed using flow cytometry in 41 ESRD patients (21 males/ 20 females) at two different time points, i) at pre dialysis state (ESRD-T0) and ii) six months later (ESRD-T6), while being stable on hemodialysis (HD) or peritoneal dialysis (PD). Twenty age matched healthy volunteers served as controls. The results of the study showed a significant reduction in both the percentage and total number of T cells compared to controls (1382+605 vs 2311+419, p<0,001) while neutrophil number was not significantly affected [4659 (3757-6440) vs 3850 (3490-4193)]. This finding is in agreement with that of the majority of previously published studies. Another interesting finding of the study was that CKD patients had increasead percentage of CD4CD28null T cells (7.6+7.8 vs 3+2.3 p<0.001) as well as CD8CD28null T cells (46.4+20.5 vs 35.4+14.1, p= 0.029) compared to controls. As mentioned previously, loss of CD28 expression is a feature of highly differentiated T cells after repeated antigen stimulation and appears to be a marker of immunological aging. These exhausted T cells, despite the loss of their effector functions seem to retain some cytotoxic functions. More specificly, CD4CD28null T cells have been extensively studied in atherosclerotic cardiovascular disease. There are no published studies about the role of CD8CD28null T cells so far. In our study population, both CD4CD28null and CD8CD28null T cells seem to increase in parallel levels. In addition, a high percentage of both subpopulation in our CDK subjects correlated with CMV seropositivity (IgG CMV+). This finding suggests that loss of CD28 expression in CKD patients seems to be driven by a common stimulating factor, which could be the accumulation of uremic toxins or possibly CMV chronic re-activation. This phenomenon has been described in other conditions such as autoimmune diseases and CKD. Several previous studies have associated CMV seropositivity with a relative risk of CVD, although conclusions are still inconcistent.As a secondary outcome CD28null T cells correlated with intima media thickness of the carotid artery. Some of these findings are in agreement with previous studies that have described a positive correlation between CD4CD28null and IMT. However, there are no previous studies estimating the result of CD28 elimination on CD8 cells, namely the correlation between CD8CD28null T cells and IMT. Our results sugest a potential new role for CD8CD28null T cells in atherosclerotic CVD. Furthermore, another important finding of our study was that both total CD4 and Treg numbers were decreased compared to controls. It is well known that CKD affects almost all T cell subsets, but mostly naïve and memory T cells. Previous studies have reported a decrease in total lymphocytes, NK cells and Tregs along with the progression of GFR decline. Low levels of Tregs in CKD and dialysis populations have been proposed as potential risk factors for allograft rejection. A rather interesting and novel finding of the second phase of the study is that hemodialysis led to a significant further reduction in Treg cells while CD4CD28null cells increased. On the other hand, patients who started on peritoneal dialysis, retained a rather favorable immunological profile considering Tregs and CD4CD28null T cells. To the best of our knowledge, this is the first study to report a favorable outcome in immunological patient profile of peritoneal dialysis versus hemodialysis. These novel findings need to be investigated in larger study population groups, as they may be extremely important for patients awaiting kidney transplantation, while selecting dialysis method to start on. In terms of the immunological profile, peritoneal dialysis seems to have a favorable effect, as it retains Treg cell numbers and have a lower impact in CD4CD28null T cells than hemodialysis, resulting in a lower risk of cardiovascular complications. Nevertheless, these findings need to be confirmed in larger randomized studies. Finally, in an effort to assess the impact of diabetes mellitus on these immune alterations, diabetic CKD patients were also studied as a subpopulation, and their immunological profile was compared to that of CKD patients without diabetes mellitus. In patients with diabetes, both CD4CD28null and CD8CD28null cells were significantly increased before starting on dialysis compared to CKD patients without diabetes mellitus. Patients on hemodialysis showed a further increase in CD8CD28null T cells, while on the contrary, there was a decrease in CD4CD28null T cells in diabetic patients commencing on peritoneal dialysis. This finding suggests a possible benefit for the diabetic CKD patients that choose peritoneal dialysis in terms of cardiovascular complications. We believe that all these novel and extremely interesting results need to be confirmed in long term observational studies.

Η αλληλεπίδραση ανοσοποιητικού συστήματος και νεφρικών νοσημάτων είναι γνωστή, καθώς αφενός διαταραχές του ανοσοποιητικού συστήματος οι οποίες εμφανίζονται ως αποτέλεσμα συστηματικών νοσημάτων, φαρμακευτικής αγωγής, νεοπλασματικών παθήσεων κλπ, μπορούν να επιδρούν στη δομή και λειτουργία των νεφρών και αφετέρου, η χρόνια νεφρική νόσος, μέσω άγνωστων μηχανισμών, επιδρά στο ίδιο το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού με ολέθριες συνέπειες, όπως λοιμώξεις, νεοπλασματικές παθήσεις και καρδιαγγειακά νοσήματα που αποτελούν και τις κύριες αιτίες αυξημένης νοσηρότητας και θνητότητας των ασθενών αυτών. Ως σήμερα, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για το χρονικό διάστημα εμφάνισης, τους μηχανισμούς ανάπτυξης και τις συγκεκριμένες διαταραχές που συμβαίνουν και αφορούν κυρίως την επίκτητη ανοσία.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει τις μεταβολές σε υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκυττάρων σε διαβητικούς και μη διαβητικούς ασθενείς με ΧΝΝ τελικού σταδίου καθώς και την επίδραση της εξωνεφρικής κάθαρσης στις μεταβολές αυτές.Πρόκειται για προοπτική μελέτη παρατήρησης, η οποία χωρίστηκε σε δύο κύριες φάσεις. Στην πρώτη φάση αξιολογήθηκε η λεμφική σειρά, με εστιασμό στα Τ λεμφοκύτταρα (CD3+ κύτταρα), των οποίων εκτιμήθηκε το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός τους, όπως και διάφοροι υποπληθυσμοί σε ασθενείς με ΧΝΝ τελικού σταδίου πριν την ένταξη σε αιμοκάθαρση. Οι υποπληθυσμοί των Τ λεμφοκυττάρων που αξιολογήθηκαν ήταν τα CD4+, CD8+, Natural Killer (CD16+CD56+), τα T regulatory cells (CD25+FOXP3+) καθώς και τα CD4+CD28null και CD8+CD28null κύτταρα. Έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων με ομάδα υγειών μαρτύρων, παρόμοιας φυλής, φύλου και ηλικίας, καθώς και συσχέτιση με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους των ασθενών. Στη δεύτερη φάση της μελέτης οι ασθενείς επαναξιολογήθηκαν 6 μήνες μετά, εφόσον είχαν ενταχθεί σε πρόγραμμα υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας, είτε με ΤΝ είτε με ΣΦΠΚ και εκτιμήθηκε η θετική ή αρνητική επίδραση της μεθόδου στην έκφραση των υποπληθυσμών αυτών. Στην πρώτη φάση της μελέτης διαπιστώθηκε σημαντική λεμφοπενία, με ελάττωση τόσο του απόλυτου αριθμού όσο και του ποσοστού των Τ λεμφοκυττάρων, στους ασθενείς με ΧΝΝ σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες στον χρόνο Τ0, δηλαδή αμέσως πριν την ένταξη σε εξωνεφρική κάθαρση. Η πτώση των λεμφοκυττάρων δεν συνοδεύτηκε από αντίστοιχη ελάττωση του αριθμού των ουδετερόφιλων, με αποτέλεσμα να έχουμε αύξηση του λόγου των ουδετερόφιλων προς τα λεμφοκύτταρα (αύξηση του NLR). Το εύρημα αυτό είναι σημαντικό και συμβαδίζει με το σύνολο των δημοσιευμένων μελετών σύμφωνα με τις οποίες η προοδευτική επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας σε ασθενείς με ΧΝΝ οδηγεί σε ελάττωση του αριθμού των κυττάρων της λεμφικής σειράς ενώ τα κύτταρα της μυελικής σειράς παραμένουν ανεπηρέαστα. Οι πιθανοί παράγοντες που επιδρούν και προκαλούν την προοδευτική λεμφοπενία των ασθενών με ΧΝΝ είναι πολλοί, φαίνεται όμως ότι η επίδραση της ουραιμίας αφορά κυρίως τα παρθένα Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία μειώνονται σημαντικά. Επιδημιολογικά, η λεμφοπενία φαίνεται να συνδέεται εν μέρη με τη δράση ουραιμικών τοξινών στα προδρομικά stem cells του μυελού των οστών και όπως αναφέρεται από πολλούς ερευνητές δεν αναστρέφεται μετά τη μεταμόσχευση. Παράλληλα, από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, ο πληθυσμός ο οποίος φάνηκε να παρουσιάζει τις πιο σημαντικές διαφορές μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων ήταν τα CD28nullT λεμφοκύτταρα, το ποσοστό των οποίων ήταν σημαντικά αυξημένο στους ασθενείς με ΧΝΝ και η αύξηση αυτή αφορούσε τόσο τα CD4CD28null όσο και τα CD8CD28null λεμφοκύτταρα. Όπως είναι γνωστό, ο υποδοχέας CD28 εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και κατά την παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα απαιτείται και η ταυτόχρονη σύνδεση του CD28 μορίου με τον υποδοχέα CD80/81 στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, ώστε να ακολουθήσει ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμός και ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων για να είναι ικανά να αντιμετωπίσουν το υπεύθυνο αντιγόνο. Η ύπαρξη μιας χρόνιας φλεγμονής, με την επαναλαμβανόμενη διέγερση των Τ λεμφοκυττάρων, θα οδηγήσει σε απώλεια του CD28 υποδοχέα ως μέσο προσαρμογής και προφύλαξης από την υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να σχετίζονται με την ηλικία, αλλά παρατηρούνται και σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, όπου έχουν κυρίως μελετηθεί. Η χρόνια νεφρική νόσος, τόσο πριν όσο και μετά την ένταξη σε αιμοκάθαρση, χαρακτηρίζεται από χρόνια φλεγμονώδη αντίδραση και είναι πολύ πιθανό να σχετίζεται με τη σταδιακή ελάττωση της έκφρασης του CD28 υποδοχέα στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων. Το ενδιαφέρον στοιχείο είναι ότι η αύξηση των CD28null και κυρίως των CD4CD28null Τ λεμφοκυττάρων, έχει αναγνωριστεί πλέον ως μη παραδοσιακός παράγοντας κινδύνου για οξέα στεφανιαία επεισόδια, τόσο στο γενικό πληθυσμό όσο και στους ασθενείς με χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα. Η συσχέτιση των CD28null Τ λεμφοκυττάρων με τον αυξημένο καρδιαγγειακό κίνδυνο επιβεβαιώνεται από τα ευρήματα της μελέτης μας, καθώς διαπιστώθηκε σημαντική συσχέτιση του IMT, που αποτελεί δείκτη πρώιμης αθηρωμάτωσης, με το ποσοστό των CD8CD28null Τ λεμφοκυττάρων και κυρίως με το ποσοστό του συνόλου των CD28null Τ λεμφοκυττάρων. Πρέπει να τονιστεί ότι οι μέχρι τώρα μελέτες εστίαζαν στην αύξηση των CD4+CD28null λεμφοκυττάρων ως παράγοντα καρδιαγγειακού κινδύνου. Πρόσφατα ευρήματα ωστόσο αποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο και των CD8+CD28null λεμφοκυττάρων ως παράγοντα καρδιαγγειακού κινδύνου και αθηροσκλήρωσης ενώ επίσης αποδεικνύουν τη συσχέτισή τους με τη ρύθμιση του σακχαρώδους διαβήτη . Τέλος όσον αφορά τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα παρατηρείται ελαττωμένος απόλυτος αριθμος Tregs στους ασθενείς με ΧΝΝ τελικού σταδίου ενω η πτώση των Tregs φαίνεται να επιδεινώνεται με την ένταξη των ασθενών σε αιμοκάθαρση. Παράλληλα φαίνεται να αυξάνεται και το ποσοστό των CD4CD28null Τ λεμφοκυττάρων ενώ το φαινόνενο αυτό δεν παρατηρειται στους ασθενείς που εντάχθηκαν σε περιτοναική κάθαρση. Μια επιπλέον σημαντική παρατήρηση αφορά το αυξημένο ποσοστό των CD4+CD28null και των CD8+CD28null κυττάρων στους διαβητικούς σε σύγκριση με τους μη διαβητικούς ασθενείς. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το ποσοστό των CD28null κυττάρων (CD4 + CD8) είναι υψηλότερο στους διαβητικούς ασθενείς (p=0,041) σε σύγκριση με τους μη διαβητικούς. Τέλος η εφαρμογή εξωνεφρικής κάθαρσης, στην παρούσα μελέτη, φάνηκε να επηρεάζει το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των Τ λεμφοκυττάρων καθώς διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση 6 μήνες μετά την ένταξη, τόσο σε αιμοκάθαρση όσο και σε περιτοναϊκή κάθαρση. Παράλληλα, σημαντικές και πολύ ενδιαφέρουσες μεταβολές εμφανίστηκαν στο ποσοστό των CD28null Τ λεμφοκυττάρων μετά την ένταξη σε μέθοδο υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας. Πιο συγκεκριμένα, 6 μήνες αργότερα, στον χρόνο T6, υπό σταθερές συνθήκες και ενώ είχαν αποκλειστεί εξωγενείς παράγοντες, πχ λοίμωξη, οι ασθενείς οι οποίοι εντάχθηκαν σε αιμοκάθαρση παρουσίασαν σημαντική αύξηση του συνόλου των CD28null και ιδιαίτερα των CD8+CD28null κυττάρων ενώ τα CD4+CD28null κύτταρα παρουσίασαν μικρή μη σημαντική αύξηση. Αντίθετα, έξι μήνες μετά την έναρξη της περιτοναϊκής κάθαρσης, οι ασθενείς εμφάνισαν μείωση τόσο του ποσοστού όσο και του απόλυτου αριθμού των CD28null κυττάρων και η μείωση αυτή αφορούσε κυρίως το ποσοστό των CD4+CD28null κυττάρων ενώ αντίθετα αυξήθηκαν σημαντικά τόσο ο αριθμός των CD4 κυττάρων όσο και ο λόγος CD4/CD8. Το γεγονός ότι η μία μέθοδος, ΤΝ, επιδρά δυσμενώς στην έκφραση των γερασμένων μορφών και «αθηρογόνων» υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων ενώ η άλλη, ΣΦΠΚ, ελαττώνει τη συγκέντρωσή τους στο αίμα, προωθώντας την παραγωγή λιγότερο εξελιγμένων υποπληθυσμών, προσδίδει ένα πιθανό πλεονέκτημα της ένταξης σε περιτοναϊκή κάθαρση συγκριτικά με την αιμοκάθαρση και σηματοδοτεί μια ευνοϊκή επίδραση στο ανοσολογικό προφίλ των ασθενών, με έμφαση κυρίως στους παράγοντες αθηρωμάτωσης και καρδιαγγειακού κινδύνου. Τα δεδομένα όσον αφορά την υπεροχή της περιτοναϊκής κάθαρσης στη διατήρηση ευνοϊκού ανοσολογικού προφίλ των ασθενών είναι λίγα και αντικρουόμενα. Μένει τα ενδιαφέροντα αυτά συμπεράσματα να ελεγχθούν σε μεγάλες τυχαιοποιημένες μελέτες παρατήρησης.