Περιεκτικότητα ελληνικών πληθυσμών του είδους Silybum marianum (L.) Gaertn. σε σιλυμαρίνη και στα βιοδραστικά της συστατικά και μελέτη της επίδρασης καλλιεργητικών τεχνικών (πυκνότητα σποράς και εφαρμογή του ρυθμιστή ανάπτυξης mepiquat chloride) στην αύξηση, στην ποσοτική και ποιοτική απόδοση της καλλιέργειας

Abstract

Milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) is an annual or biennial species native to the Mediterranean basin that is now spread worldwide and it is grown as a medicinal plant in several countries. Silymarin, a mixture of compounds that is contained in the extract from milk thistle seeds, has numerous pharmacological activities. Dietary supplements containing silymarin are among the most popular natural products. Moreover, the seeds and whole plant biomass can be used for oil and bioenergy production, respectively. Farmers use seeds from wild populations as propagation material for milk thistle cultivation, although a few cultivated varieties are available for commercial production. Consequently, it is imperative that native populations are evaluated and characterised for efficient use in milk thistle breeding programmes. Milk thistle yield and quality (i.e., silymarin content) is dependent not only on to the genotype, the geographical location and the weather conditions but also on the agronomic conditions. In the framework (context) of this thesis a study was designed and conducted in order to evaluate thirty four native Greek milk thistle populations and to estimate the diversity regarding the silymarin content and the variability in silymarin components. Moreover, antioxidant activity assays were also carried out. Other studies, field experiments, were conducted to determine the effects of a plant growth regulator (mepiquat chloride) and crop density on milk thistle growth, seed yield, and silymarin accumulation and to evaluate the silymarin content in milk thistle seeds harvested at different ripening stages. Also, experiments were conducted for the separation of silymarin and its constituents using the innovative method of molecular imprinting and the techniques of bulk polymerization and electrospinning. The characterisation of 30 wild milk thistle populations revealed a relatively low amount of variation in most studied phenotypic traits. Regarding silymarin content a relatively high amount of variation was identified. The average value across all populations was 3.29%, while the values were ranging from 2.31 to 7.71%. Furthermore, significant differences were also observed regarding the relative proportion of silymarin constituents. Our results indicate that an interesting genetic resource for exploitation in milk thistle breeding programmes exists in Greece, especially the ‘Spata’ and ‘Kastoria’ populations due to their high content of silymarin, silybin A, and silybin B. The results of the field experiments showed that plant density had a significant impact on milk thistle crop growth and seed yield. The plant growth regulator treatment had a moderate effect regarding the plant height (7.9–14.8% reduction), while it did not affect other crop traits and none of the mepiquat chloride treatments showed any phytotoxic effect on the milk thistle crop. Moreover, the impact of climatic conditions on milk thistle production and quality was significant. Seed yield varied between 95.3 to 222.0 kg ha-1, while silymarin yield varied between 3.3 to 6.4 kg ha-1. The evaluation of silymarin content in milk thistle seeds harvested at different ripening stages revealed that the content of oil and silymarin is increasing as the flower heads get more ripe. Also, the seeds of the main flower heads ripen earlier. A study was conducted in order to prepare molecular imprinted polymers for silymarin and to develop methods for the isolation of silymarin and its constituents from thistle seed extracts. Conventional imprinting by radical polymerization of vinyl monomers in the presence of silybin showed that silybin inhibits polymerization, possibly by free radical scavenging. Imprinting of silybin by electrospinning showed that this method is more effective and requires further study.

Το φυτό γαϊδουράγκαθο (Silybum marianum (L.) Gaertn.) είναι ιθαγενές φυτό της λεκάνης της Μεσογείου, το οποίο τώρα έχει εξαπλωθεί και εντοπίζεται σε όλο τον κόσμο. Το γαϊδουράγκαθο καλλιεργείται ως φαρμακευτικό φυτό σε διάφορες χώρες λόγω των φαρμακευτικών ιδιοτήτων του που οφείλονται στη σιλυμαρίνη, ένα μείγμα διαφόρων ουσιών που περιέχεται στο εκχύλισμα των σπόρων. Ακόμη, τα συμπληρώματα διατροφής με γαϊδουράγκαθο (σιλυμαρίνη) βρίσκονται ανάμεσα στα πιο δημοφιλή φυτικά προϊόντα. Επίσης, οι σπόροι και η βιομάζα ολόκληρου του φυτού μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή ελαίου και ενέργειας αντίστοιχα. Οι γεωργοί χρησιμοποιούν σπόρους από φυσικούς πληθυσμούς-βιοτύπους ως υλικό πολλαπλασιασμού για την καλλιέργεια του γαϊδουράγκαθου, αν και διάφορες ποικιλίες είναι διαθέσιμες για εμπορική παραγωγή. Επομένως, είναι ανάγκη να αξιολογούνται και να χαρακτηρίζονται οι αυτοφυείς πληθυσμοί ώστε να χρησιμοποιούνται σε προγράμματα βελτίωσης του γαϊδουράγκαθου. Η απόδοση και η ποιότητα του γαϊδουράγκαθου (π.χ. η περιεκτικότητα των σπόρων σε σιλυμαρίνη) εκτός από τον γονότυπο, τη γεωγραφική θέση της καλλιέργειας και τις καιρικές συνθήκες εξαρτάται και από τις εφαρμοζόμενες καλλιεργητικές τεχνικές. Στο πλαίσιο της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής σχεδιάστηκε και διεξήχθη μια εκτεταμένη μελέτη με σκοπό την αξιολόγηση τριάντα τεσσάρων γηγενών πληθυσμών γαϊδουράγκαθου κυρίως ως προς την περιεκτικότητά τους σε σιλυμαρίνη και στα βιοδραστικά συστατικά της. Επιπλέον, έγινε εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισμάτων των σπόρων των πληθυσμών. Ακόμη, πραγματοποιήθηκαν πειράματα στο αγρόκτημα Βελεστίνου, σε τρεις καλλιεργητικές περιόδους, για τη μελέτη της επίδρασης της πυκνότητας της καλλιέργειας και των ρυθμιστών ανάπτυξης στην ανάπτυξη, την ποιότητα και την απόδοση του φυτού σε σιλυμαρίνη, ενώ έγινε και αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε σιλυμαρίνη σπόρων του φυτού σε διαφορετικά στάδια ωρίμανσης. Τέλος, διεξήχθηκαν πειράματα απομόνωσης της σιλυμαρίνης και των συστατικών της με την καινοτόμο μέθοδο της μη-ομοιοπολικής μοριακής αποτύπωσης χρησιμοποιώντας τις τεχνικές του πολυμερισμού διαλύματος και της ηλεκτροστατικής ινοποίησης. Η μελέτη των πληθυσμών από διάφορες περιοχές της Ελλάδας έδειξε ότι υπάρχει μικρή παραλλακτικότητα στα κύρια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Όσον αφορά την περιεκτικότητα των σπόρων σε σιλυμαρίνη διαπιστώθηκε σχετικά μεγάλη διακύμανση, με τις τιμές να κυμαίνονται από 2,31 έως 7,71% και τον μέσο όρο της περιεκτικότητας να είναι 3,29%. Ακόμη, μεγάλη διακύμανση μεταξύ των πληθυσμών καταγράφηκε στην περιεκτικότητα των κύριων συστατικών της σιλυμαρίνης στους σπόρους. Μέσω της ιεραρχικής ανάλυσης κατά συστάδες οι πληθυσμοί ταξινομήθηκαν σε τρεις ομάδες (5 συστάδες). Τέλος, αρκετοί από τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν αποτελούν μια πολύτιμη γενετική πηγή και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε προγράμματα βελτίωσης του γαϊδουράγκαθου για τη δημιουργία ποικιλιών, ιδιαίτερα οι πληθυσμοί ‘Σπάτα’ και ‘Καστοριά’ λόγω της μεγάλης περιεκτικότητάς τους σε σιλυμαρίνη καθώς και σε σιλυβίνη (Α και Β). Η πειραματική καλλιέργεια του γαϊδουράγκαθου έδειξε ότι η πυκνότητα των φυτών είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη και την απόδοση της καλλιέργειας. Ο ρυθμιστής ανάπτυξης, mepiquat chloride, είχε μέτρια επίδραση στο ύψος των φυτών (μείωση από 7,9 έως 14,8%), ενώ δεν επηρέασε τα άλλα χαρακτηριστικά της καλλιέργειας που μελετήθηκαν, ούτε παρουσίασε κάποια φυτοτοξική επίδραση. Ακόμη, διαπιστώθηκε ότι οι καιρικές συνθήκες επηρέασαν την απόδοση της καλλιέργειας του γαϊδουράγκαθου. Η απόδοση σε σπόρο κυμάνθηκε μεταξύ 95,3 και 222,0 kg/στρέμμα, ενώ η απόδοση σε σιλυμαρίνη κυμάνθηκε μεταξύ 3,3 και 6,4 kg/στρέμμα. Από τη μελέτη των σπόρων που έγινε σε διαφορετικά στάδια ωρίμανσης διαπιστώθηκε ότι η περιεκτικότητα των σπόρων σε έλαιο και σιλυμαρίνη αυξάνεται όσο αυξάνεται ο βαθμός ωρίμανσης των σπόρων και ότι οι σπόροι των κεντρικών κεφαλών ωριμάζουν νωρίτερα από τους σπόρους των πλευρικών κεφαλών. Μελετήθηκαν οι διαδικασίες παρασκευής μοριακά αποτυπωμένων σε σιλυμαρίνη πολυμερών για την ανάπτυξη μεθόδων απομόνωσης της σιλυμαρίνης και των συστατικών της από εκχυλίσματα σπόρων γαϊδουράγκαθου. Η συμβατική αποτύπωση με ριζικό πολυμερισμό βινυλικών μονομερών παρουσία της σιλυβίνης κατέδειξε ότι η σιλυβίνη αναστέλλει πλήρως τον πολυμερισμό, πιθανώς δεσμεύοντας τις ελεύθερες ρίζες του εκκινητή. Η αποτύπωση της σιλυβίνης με την τεχνική της ηλεκτροστατικής ινοποίησης έδειξε ότι αυτή η μέθοδος είναι πιο αποτελεσματική και χρίζει περαιτέρω μελέτης.