Παραλαβή, ανάλυση με χρωματογραφικές - φασματοσκοπικές μεθόδους και βιολογική δράση αιθερίων ελαίων αρωματικών φυτών

Abstract

This work mainly involved the extraction, analysis and study of biological activity of essential oils from aromatic plants. Key aspects of the study were i) the isolation of essential oil from aromatic plants, the determination of their chemical composition by GC-MS and the assessment of their antimicrobial activity against phytopathogenic fungi and bacteria, ii) the application of Fourier Transform Raman (FT-Raman) spectroscopy for the analysis and characterization of the isolated oils from aromatic plants and from commercial samples and iii) the application of ultrasound for the extraction of the oils from dried plant material.Oregano, thyme, dictamnus, marjoram, lavender, sage, rosemary and pennyroyal are species of the Lamiaceae family and were used as primary sources for essential oils. The aforementioned plants are rich in essential oils. They are also naturally abundant in Greece, where the systematic cultivation of selected species has also been endorsed in recent years. In addition, the main essential oil of Chios mastic gum (Anacardiaceae family) was included in the FT-Raman studies. This mastic gum is a traditional product of Chios island which could be standardized with a simple and rapid FT-Raman method.Antimicrobial activity was assessed against Pénicillium digitatum, Botrytis cinerea, Fusarium sp. {Fusarium solani var. coerulum) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Antifungal activity was determined by the effect of the essential oils on fungal radial growth and conidial germination and production. Antibacterial activity (in the case of Clavibacter michiganensis subsp. michiganesis) was determined by the effect of essential oils on the bacterium’s colony forming ability on Nutrient Agar (NA) plates.Essential oils containing carvacrol and thymol exhibited a broad range of activity at relatively low concentrations. Essential oils, which contained linalool and pulegone showed lower levels of toxicity, which varied in respect to the species and the physiological activity observed. The lowest antimicrobial activity amongst the essential oils studied was noted in the case of eucalyptol-containing oils, whose effect heavily depended on the microbe species and the presence of other constituents in the mixture.FT-Raman spectra were obtained using common essential oil components and essential oils extracted from plants of the Lamiaceae family. The results show that Raman peaks correlate directly with the main constituents of the essential oil. Information from the spectra on essential oil composition was compared to GC-MS data for the same oils. FT-Raman and GC-MS analysis results were in agreement. FT- Raman spectra may be thus used as “fingerprints” for the identification of different essential oils and the characterization of dominant components for an essential oil mixture. FT-Raman spectroscopy was particularly suited for the identification of essential oil components when the chemical compounds in question produced identical mass spectra or eluted at very close times.Calibration curves for a-pinene and /3-myrcene, which are prime constituents of mastic gum essential oils, were prepared and used for FT-Raman analysis of relevant oils. The results of the FT-Raman studies and respective GC-MS data in regards to essential oil composition were once more in agreement. Thus, an FT-Raman method for quantitative determination of α-pinene and /3-myrcene was developed.In several cases, the extraction process was assisted with the application of ultrasound. Water and organic solvent (1:1, v/v) were used as a solvent system in all ultrasound-assisted extractions, n-pentane or diethylether being the choices of organic solvent. A process of microsteam distillation / extraction in organic solvent was used as a control method. Chemical composition of the essential oils was determined by GC-MS. Using the water/diethylether system, the chemical compositions observed for the extracted essential oils were similar to the ones observed for essential oils extracted using the control method. One notable exception to this concerns pennyroyal samples. The water/pentane system, on the other hand, resulted in qualitatively different extracts. This system seems to be particularly suited for the extraction of thymol and carvacrol from plants with low content in respect to these compounds.Consequently:i) All the essential oils in this work exhibited antimicrobial activity against the plant microbes studied. The activity of essential oils from dictamnus and marjoram is comparable with the antimicrobial activity of oregano and thyme, ii) FT-Raman spectroscopy may be used for the identification and discrimination of essential oils. It is also suited for the identification of different chemotypes in regards to essential oil composition. In the case of mastic gum oils, it may be used for quantitative determinations targeted at the standardization of mastic gum products in respect to a- pinene and /3-myrcene content.iii) The application of ultrasound in water/diethylether extractions yielded samples of essential oils, which are considered representative for each plant. Similar extractions using a water/pentane system resulted in mixtures rich in biologically active compounds.

Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελούν τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών. Τρεις στόχους είχε η μελέτη αυτή. Ο πρώτος, είχε ως αντικείμενο την παραλαβή των αιθέριων ελαίων από τους φυτικούς ιστούς, την ανάλυσή τους με αέριο χρωματογραφία - φασματομετρία μαζών (Gas Chromatography - Mass Spectrometry, GC-MS) για τον προσδιορισμό της χημικής τους σύστασης και την αξιολόγηση της βιολογικής τους δράσης σε φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς. Ο δεύτερος στόχος, είχε ως αντικείμενο την εφαρμογή της φασματοσκοπίας Raman μετασχηματισμού Fourier (Fourier Transform Raman, FT- Raman) για τη μελέτη των αιθέριων ελαίων, σε δείγματα που παραλήφθηκαν από τους φυτικούς ιστούς, αλλά και δείγματα εμπορίου. Αντικείμενο του τρίτου στόχου αποτέλεσαν οι υπέρηχοι ως βάση μεθόδου εκχύλισης για την παραλαβή αιθέριων ελαίων από το αποξηραμένο φυτικό υλικό.Επιλέχθηκαν αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae, όπως η ρίγανη, το θυμάρι, ο δίκταμος, η μαντζουράνα, η λεβάντα, το φασκόμηλο, το δενδρολίβανο κοα. το φλησκούνι, διότι αποτελούν κοινά είδη στην Ελλάδα και σχετικά άφθονα, είτε σαν αυτοφυή είτε σαν καλλιεργούμενα φυτά και γιατί έχουν (στην πλειονότητά τους τουλάχιστο) καλές αποδόσεις σε αιθέριο έλαιο. Επίσης, στη φασματοσκοπική FT- Raman μελέτη συμπεριλήφθηκε το αιθέριο έλαιο της μαστίχας (Οικ. Anacardiaceae), διότι αποτελεί παραδοσιακό προϊόν της Χίου, με σκοπό την εύρεση μιας ταχείας και απλής μεθόδου για την τυποποίηση του μαστιχελαίου.Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων μελετήθηκε έναντι των μικροοργανισμών Pénicillium digitatum, Botrytis cinerea, Fusarium sp. (Fusarium solani var. coerulum) και Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis mv προσβάλλουν φυτικά είδη και προϊόντα. Ως μέθοδοι μελέτης χρησιμοποιήθηκαν πειράματα μέτρησης της γραμμικής αύξησης του μυκηλίου όλων των μυκήτων και πειράματα βλάστησης και παραγωγής των κονιδίων του μύκητα Pénicillium digitatum σε θρεπτικό υλικό Potato Dextrose Agar (PDA) ενώ στην περίπτωση του βακτηρίου Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis η βιολογική δράση των αιθέριων ελαίων αξιολογήθηκε μετρώντας την ανάπτυξη αυτού σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό Nutrient Agar (ΝΑ). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως όλα τα εξεταζόμενα αιθέρια έλαια παρουσίασαν αντιμικροβιακή δράση και στα τέσσερα φυτοπαθογόνα που δοκιμάστηκαν. Τα αιθέρια έλαια που περιέχουν θυμόλη και καρβακρόλη έχουν ισχυρή και ευρέους φάσματος αντιμικροβιακή δράση σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ τα αιθέρια έλαια που περιέχουν λιναλοόλη και πουλεγόνη επιδεικνύουν παρεμποδιστική ιδιότητα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, που εξαρτάται από τη φυσιολογική λειτουργία του μύκητα, αλλά και το είδος του μικροοργανισμού. Τα λιγότερο δραστικά έλαια είναι αυτά που περιέχουν ευκαλυπτόλη. Η δράση τους εξαρτάται από το είδος του μικροοργανισμού και την παρουσία άλλων ουσιών στο μίγμα. Εξετάστηκαν FT-Raman φάσματα συστατικών που περιέχονται σε αιθέρια έλαια, καθώς και τα φάσματα των αιθέριων ελαίων της οικογένειας Lamiaceae. Συσχετίζοντας τα FT-Raman φάσματα των καθαρών τερπενίων με αυτά των αιθέριων ελαίων, προκύπτει πως στο φάσμα του αιθέριου ελαίου εμφανίζονται χαρακτηριστικές κορυφές που αποδίδονται στην κύρια ή κύριες ουσίες του ελαίου. Οι προβλέψεις των κύριων συστατικών των αιθέριων ελαίων από τα φάσματα FT-Raman επιβεβαιώνονται από τα αποτελέσματα GC-MS. Το φάσμα FT-Raman ενός αιθέριου ελαίου αποτελεί «δακτυλικό αποτύπωμα» για το ίδιο και χαρακτηρίζεται από την επικρατέστερη ουσία στο μίγμα, με αποτέλεσμα να είναι εφικτή η διαφοροποίηση των αιθέριων ελαίων μεταξύ τους, ανάλογα με τα συστατικά που επικρατούν σ’αυτά. Επιπλέον, είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ των διαφορετικών χημειότυπων ενός αιθέριου ελαίου, όπως είναι της καρβακρόλης και της θυμόλης, ενώ σε συνδυασμό με την τεχνική GC-MS επιβεβαιώνει την ταυτοποίηση ουσιών των οποίων τα φάσματα μάζας τους είναι όμοια και εκλούονται σε πολύ κοντινούς χρόνους. Επιπλέον, αναπτύσσεται μέθοδος προσδιορισμού της εκατοστιαίας περιεκτικότητας του μαστιχελαίου σε α-πινένιο και β-μυρκένιο με τη φασματοσκοπία FT-Raman. Για το λόγο αυτό, ελήφθησαν καμπύλες αναφοράς για τα δύο αυτά κύρια συστατικά του, από τις οποίες υπολογίζονται τα % ποσοστά του α-πινενίου και β-μυρκενίου σε άγνωστα δείγματα μαστιχελαίων. Τα αποτελέσματα της μεθόδου FT-Raman συγκρίνονται με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τη μέθοδο GC-MS. Η μέθοδος παραλαβής των αιθέριων ελαίων από τα αποξηραμένα φυτά που βασίζεται στους υπερήχους, διαρκεί μόλις λίγα λεπτά. Η μέθοδος πραγματοποιήθηκε σε λουτρό υπερήχων που λειτουργεί σε συχνότητα 35 KHz. Ως εκχυλιστικό υγρό χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα νερού/οργανικού διαλύτη (1:1, ν/ν). Οι οργανικοί διαλύτες ήταν το πεντάνιο και ο διαιθυλαιθέρας. Η μικροαπόσταξη - εκχύλιση σε οργανικό διαλύτη αποτέλεσε τη μέθοδο αναφοράς. Η χημική σύσταση των παραλαμβανόμενων αιθέριων ελαίων προσδιορίστηκε με GC-MS. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως η ποιότητα του λαμβανόμενου αιθέριου ελαίου, στην περίπτωση της μεθόδου που βασίζεται στους υπερήχους, εξαρτάται από το σύστημα διαλυτών που χρησιμοποιείται για εκχύλιση. Όταν χρησιμοποιηθεί το σύστημα νερού/διαιθυλαιθέρα το αιθέριο έλαιο που παραλαμβάνεται είναι παρόμοιας χημικής σύστασης με αυτό της μεθόδου αναφοράς (με εξαίρεση το αιθέριο έλαιο του φλησκουνιού). Όταν χρησιμοποιηθεί το σύστημα νερό/πεντάνιο οι ποιοτικές διαφορές μεταξύ των εκχυλισμάτων είναι σημαντικές και διακρίνονται διάφορες περιπτώσεις ανάλογα με τη φύση του αιθέριου ελαίου. Γενικά, με το σύστημα αυτό παραλαμβάνονται εκχυλίσματα εμπλουτισμένα, ως προς την εκατοστιαία περιεκτικότητά τους, σε βιολογικά δραστικές ουσίες, όπως είναι η θυμόλη και η καρβακρόλη, ακόμα και σε αρωματικά φυτά στα οποία το ποσοστό τους είναι σχετικά χαμηλό.Από τη μελέτη αυτή προκύπτουν τα ακόλουθα συμπεράσματα: ί) Τα αιθέρια έλαια επιδεικνύουν διάφορα επίπεδα αντιμικροβιακής δράσης που εξαρτάται από το είδος του αρωματικού φυτού και του φυτοπαθογόνου. Η βιοδραστικότητα των αιθέριων ελαίων του δίκταμου και της μαντζουράνας συγκρίνεται άμεσα με αυτή της ρίγανης και του θυμαριού, ϋ) Με τη φασματοσκοπία FT-Raman είναι εφικτή η διαφοροποίηση των αιθέριων ελαίων ανάλογα με την επικρατέστερη ουσία μεταξύ ειδών και υποειδών, επιτυγχάνοντας ακόμη τη διάκριση διαφορετικών χημειοτύπων. Όπως προκύπτει και από τα αποτελέσματα του μαστιχελαίου η φασματοσκοπία FT- Raman μπορεί να εφαρμοστεί σε ποσοτικούς προσδιορισμούς και ιδιαίτερα στην τυποποίηση των αιθέριων ελαίων, iii) Οι υπέρηχοι, ως βάση μεθόδου εκχύλισης των αιθέριων ελαίων, παραλαμβάνουν μέσα σε λίγα λεπτά το αντιπροσωπευτικό αιθέριο έλαιο του φυτού, αν χησιμοποιηθεί ως σύστημα το νερό/διαιθυλαιθέρας, ή συντελούν στην παραλαβή εκχυλίσματος με αυξημένα ποσοστά σε βιολογικά δραστικές ουσίες, αν χρησιμοποιηθεί ως σύστημα το νερό/πεντάνιο.