Διερεύνηση λειτουργικότητας της ογκοκατασταλτικής οδού του p53 στο αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα ALK-αρνητικό

Abstract

Systemic anaplastic large cell lymphoma (ALCL) without anaplastic lymphoma kinase (ALK) positivity, was recognized as a distinct disease entity in the World Health Organization's lymphoma classification in 2016 (ALK-ALCL).Multiple studies have shown its similarities and differences from systemic ALK positive ALCL, as well as from peripheral T cell lymphoma not otherwise specified (PTCL-NOS), at epidemiological, pathogenetic and therapeutic level. In contrast to ALK+ ALCL, the prognosis of ALK- ALCL is overall worse with existing therapeutic regimens, characterized by short periods of remission and disease control, typically followed by relapses with extremely poor prognosis. Therefore, discovering new treatment strategies is urgently needed. ALK- ALCL shows pathogenetic similarities to ALK + ALCL with deregulation of T cell receptor and CD30 receptor signaling pathways, as well as aberrations in JAK-STAT, PI3K-Akt-Sonic Hedgehog, MAPK-mTOR-AP1 and NF-kB signalingpathways. Abnormalities of the cytoskeleton and modification of the host’s immune response are responsible for its morphological characteristics and aggressive clinical course. ALK-ALCL is characterized by the presence of chromosomal translocations and abnormal karyotype, as well as the presence of chimeric proteins, point mutations and expression of abnormal gene transcripts. Numerous studies have highlighted the role of the p53 signaling pathway as a key regulator of cell cycle, cell’s survival, genetic repair, senescence and death, and revealed the dual role of the p53 gene as a tumor suppressor gene and potential oncogene in multicellular organisms. The role of the p53 signaling pathway, in maturation, differentiation, activation, apoptosis, and clonal T cell expansion, as well as its implication in the immune response, autoimmunity, and lymphomatogenesis, has also been investigated. p53 protein levels are mainly regulated by its interaction, with the E3 ligases MDM2 and MDMX, which modify p53 post-translationally, leading to its degradation in the proteasome. In a significant number of cases, ALCLs carry the non-mutated p53 (wt p53) protein, but the corresponding signaling pathway is inactive. In both ALK + and ALK-ALCL, reactivation of the p53 signaling pathway is possible, using small inhibitors of the MDM2 molecule. Inhibition of MDM2, caused variable inhibition of cell proliferation and apoptosis in ALCL cell lines, indicating the presence of other p53 signaling repression mechanisms. Data indicating that MDMX protein, a negative regulator of the p53 signaling pathway, is involved in inactivating p53 signaling in ALCL are presented in this dissertation. Western blot analysis showed that MDMX protein is overexpressed in ALK+ ALCL cell lines and shows varied expression in ALK-ALCL cell lines. Immunohistochemical analysis for MDMX protein in biopsy material from patients with ALK+ ALCL and ALK-ALCL showed increased expression of MDMX in 78% of patients with ALK+ ALCL and in 41% of patients with ALK-ALCL (p <0.0018 Mann Whitney test). In situ fluorescent hybridization (FISH) analysis, showed profound amplification of the MDMX gene in 8% (1/13) of patients with ALK- ALCL as well as low levels of multiple copies of the MDMX gene in 15% (2/13) of patients with ALK-ALCL and in 27% (3/11) of patients with ALK+ ALCL.Pharmaceutical inhibition of MDMX, as well as silencing of the MDMX gene using siRNA, were associated with reactivation of the p53 signaling pathway, cell cycle arrest, and apoptotic cell death in ALK+ and ALK- ALCL cell lines with wtp53. These findings provide evidence that MDMX targeting may be a new therapeutic approach for ALCL patients with wtp53 tumors.

Το συστηματικό αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (ALCL), χωρίς θετικότητα στην κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (ALK), αναγνωρίστηκε ως ξεχωριστή νοσολογική οντότητα, στην ταξινόμηση λεμφωμάτων του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, το 2016 (ALK-ALCL).Πολλαπλές μελέτες ανέδειξαν τις ομοιότητες αλλά και τις διαφορές του, από το συστηματικό ALK θετικό ALCL (ALK+ALCL), καθώς και από το περιφερικό Τ λέμφωμα μη περαιτέρω τυποποιούμενο (PTCL-NOS), σε επιδημιολογικό, παθογενετικό και θεραπευτικό επίπεδο. Σε αντίθεση με το ALK+ALCL, η πρόγνωση του ALK-ALCL είναι συνολικά χειρότερη, με τα υπάρχοντα θεραπευτικά σχήματα, με σύντομες περιόδους ύφεσης και ελέγχου της νόσου, που ακολουθούνται κατά κανόνα από υποτροπές, με πολύ φτωχή πρόγνωση. Για το λόγο αυτό η ανεύρεση νέων θεραπευτικών στρατηγικών αποτελεί επιτακτική ανάγκη.Το ALK-ALCL παρουσιάζει ομοιότητες με το ALK+ALCL στην παθοβιολογία του, με απορρύθμιση των σηματοδοτικών οδών του Τ κυτταρικού υποδοχέα, της σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα CD30, και των οδών JAK-STAT, PI3K-Akt -Sonic Hedgehog, MAPK-mTOR-AP1, NF-kB, και άλλων. Οι ανωμαλίες του κυτταροσκελετού, καθώς και η τροποποίηση της ανοσιακής απάντησης, ευθύνονται για τα ιστομορφολογικά χαρακτηριστικά του, και την επιθετική του κλινική πορεία. Το ALK-ALCL χαρακτηρίζεται από την παρουσία χρωμοσωμικών μεταθέσεων και ανώμαλου καρυότυπου, καθώς και παρουσία πλήθους χιμαιρικών πρωτεϊνών, σημειακών μεταλλάξεων, όπως και έκφραση ανώμαλων γονιδιακών μεταγράφων.Πολλαπλές μελέτες έχουν αναδείξει, το ρόλο της σηματοδοτικής οδού p53 σε κομβικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, της κυτταρικής επιβίωσης, της κυτταρικής γήρανσης, της επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού, του κυτταρικού θανάτου, όπως και το διττό ρόλο του γονιδίου p53 σαν δυνητικού ογκογονιδίου αλλά και σαν ογκοκατασταλτικού γονιδίου στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Επίσης έχει διερευνηθεί ο ρόλος της σηματοδοτικής οδού p53, στην ωρίμανση, στη διαφοροποίηση, στην απόπτωση, στον κλωνικό πολλαπλασιασμό, και την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, όπως και η εμπλοκή της στην ανοσιακή απόκριση, αυτοανοσία, και λεμφωματογένεση. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης p53, ρυθμίζονται κυρίως από την αλληλεπίδρασή της, με τις Ε3 λιγκάσες MDM2 και ΜDMX, που την τροποποιούν μέταμεταφραστικά, οδηγώντας στην αποικοδόμησή της στο πρωτεόσωμα.Σε σημαντικό αριθμό περιπτώσεων, τα ALCL φέρουν μη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη p53(wt p53), αλλά το αντίστοιχο σηματοδοτικό μονοπάτι είναι ανενεργό. Τόσο στα ALK+ όσο και στα ALK-ALCL έχει ήδη αποδειχθεί, η δυνατότητα επανενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού p53, με τη χρήση μικρών μορίων αναστολέων του μορίου MDM2, που στοχεύει την πρωτεΐνη p53, για αποδόμηση στο κυτταρικό πρωτεόσωμα. Η αναστολή του MDM2, οδήγησε σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωση, σε κυτταρικές σειρές ALCL, με διαφορετικά ωστόσο επίπεδα απόκρισης μεταξύ τους, γεγονός που υποδεικνύει την παρουσία και άλλων μηχανισμών καταστολής της σηματοδοτικής οδού p53. Στην παρούσα διατριβή, παρουσιάζονται δεδομένα που υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη MDMX, ένας αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδοτικής οδού p53, εμπλέκεται στην απενεργοποίηση της σηματοδότησης στα ALCL. Με ανάλυση Western blotαποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη MDMX υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές ALK+ALCL και παρουσιάζει ποικίλη έκφραση σε κυτταρικές σειρές ALK-ALCL.Με ανοσοϊστοχημική χρώση, έναντι της πρωτεΐνης MDMX σε βιοπτικό υλικό ασθενών με ALK+ALCL και ALK-ALCL, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του MDMX, στο 78% των ασθενών με ALK+ALCL, και στο 41% των ασθενών με ALK-ALCL (p<0.0018 Mann Whitney test). Η ανάλυση με φθορίζοντα υβριδισμό in situ (FISH), έδειξε αριθμητική ενίσχυση του γονιδίου MDMX σε 8% (1/13) των ασθενών με ALK-ALCL, ενώ χαμηλά επίπεδα πολλαπλών αντιγράφων του γονιδίου MDMXβρέθηκαν σε 15% (2/13) των ασθενών με ALK-ALCL και σε 27% (3/11) των ασθενών με ALK+ALCL. Η φαρμακευτική αναστολή του MDMX, καθώς και η σίγαση του γονιδίου MDMX με τη χρήση siRNA, συσχετίστηκαν με ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού p53, αναστολή του πολλαπλασιασμού, και αποπτωτικό θάνατο στα νεοπλασματικά κύτταρα ALK+ και ALK- κυτταρικών σειρών ALCL με wtp53. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι η στόχευση του μορίου MDMX μπορεί να αποτελέσει μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για ασθενείς με ALCL και wtp53.