Μηχανισμοί δράσης προβιοτικών μικροοργανισμών σε in vitro και in vivo συστήματα

Abstract

The term probiotics was originally used to describe substances produced by a microorganism which could confer beneficial effect on the host by contributing to its intestinal flora balance (Fuller, 1989). Until then, several definitions were used to describe probiotics. However, the official definition, was given by the Food and Agriculture Organization (FAO) and World Health Organization (WHO) according to which probiotics are defined as “live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host. (FAO/WHO, 2002).The most commonly used probiotic strains include lactic acid bacteria (LAB), such as Lactobacillus, Bifidobacterium, as well as Streptococcus species. The novel potentially probiotic strains must possess certain characteristics, including acid tolerance and resistance to bile salt hydrolysis. Furthermore, the adhesion capacity of probiotics confers great advantage by increasing their interaction with the host, however this property is not a prerequisite for their action. Moreover, any potential probiotic strain should be generally recognized as safe (GRAS) and have antimicrobial activity against pathogenic bacteria (Mercenier et al., 2008). There are numerous studies indicating the health benefits attributed to probiotics, including alleviation of the symptoms of irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease. In addition, there is increasing evidence that the administration of probiotics has positive impact against various health disorders, such as mental, immunological and metabolic disorders. Furthermore, it has been demonstrated both in vitro and in vivo that probiotic microorganisms could inhibit the growth of colon cancer (Orlando et al., 2016; Tiptiri-Kourpeti et al., 2016; Ma et al., 2010), as well as other forms of cancer cells such as breast cancer (Marschalek et al., 2017).The health-promoting effect of the probiotic species seems to be strain specific and is developed through a range of molecular mechanisms, such as reinforcement of the epithelial barrier, adhesion to the intestinal mucosa, competitive pathogen exclusion, production of antimicrobial agents and modulation of host immune responses (Bermudez-Brito et al., 2012).In recent years, there is a tremendous interest in isolation of new probiotic microorganisms and their application in the development of innovative functional foods. To this end, our research team in collaboration with the Laboratory of Microbiology, Biotechnology and Hygiene, Faculty of Agricultural Development, Democritus University of Thrace, isolated novel lactic acid bacteria (LAB) from Feta-type cheese, which were screened for probiotic potential in a series of established in vitro tests, including resistance to low pH, resistance to pepsin and pancreatin and tolerance to bile salts. Furthermore, the susceptibility against common antibiotics was determined to ensure a safe exploitation of the potentially probiotic strains. The strain Lactobacillus K5, which displayed the most desirable probiotic properties, was chosen for molecular genotyping and investigation of its potential probiotic activity and mechanisms of action by employing in vitro and in vivo tests. Firstly, molecular characterization indicated that Lactobacillus K5 belongs to the paracasei species. Furthermore, a novel multiplex PCR assay, based on random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, was developed for its efficient and accurate detection in food products. Then, we investigated its mechanisms of action in vitro. In particular, employing quantitative analysis and confocal, fluorescent microscopy the adhesion properties of the above strain to Caco-2 colon cancer cells were studied. L. paracasei K5 displayed efficient adherence capacity to colon cancer cells, similarly to the reference strains L. casei ATCC 393 and L. rhamnosus GG. Moreover, we investigated the antiproliferative potential of L. paracasei K5 on cancer cells and we demonstrated that treatment of Caco-2 cells with L. paracasei K5 inhibited cell proliferation in a time-and dose-dependent manner. The anti-proliferative effects appear to be mediated through induction of apoptosis via modulation of transcription levels of specific Bcl-2 family proteins, which was also confirmed in protein level. Additionally, we demonstrated inhibition of growth of human colon cells after treatment with the conditioned medium of L. paracasei K5. Then, the mechanisms of action of L. paracasei K5 were further investigated in vivo by employing the dorsal-air-pouch mouse model, which is a well-established model of inflammation. We recorded an eight-fold increase in the recruitment of immune cells in mice treated with the potentially probiotic strain, compared to the control group. Analysis of the exudates revealed significant changes in the expression of pro-inflammatory mediators on site. Furthermore, treatment of Caco-2 cells with L. paracasei K5 induced significant upregulation of cytokines interleukin-1α (IL-1α), ΙL-1β, IL-6, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), the chemokine C-X-C motif ligand 2 (CXCL2), and the inflammation markers soluble intercellular adhesion molecule (sICAM) and metallopeptidase inhibitor-1 (TIMP-1). Transient induction of the Toll-like receptors (TLRs) 2, 4, 6, and 9 expression levels was also recorded by real-time PCR analysis. These results highlight the immunomodulatory potential of this strain and further support its probiotic character.In summary, in this study the probiotic potential of a novel Lactobacillus strain was investigated both in vitro and in vivo. Our results show that L. paracasei K5 displays significant probiotic properties and it may be used for the development of novel functional foods in furture studies.

Ο όρος προβιοτικός χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να περιγράψει ουσίες που παράγονται από κάποιο μικροοργανισμό και οι οποίες επηρεάζουν ευεργετικά τον ξενιστή, βελτιώνοντας την εντερική μικροβιακή ισορροπία του (Fuller, 1989). Ακολούθησαν διάφορες μελέτες και προτάθηκαν αρκετοί ορισμοί για να καταλήξουμε στον επίσημο ορισμό από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization - WHO) και τον Διεθνή Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας (Food and Agriculture Organization - FAO), ο οποίος ορίζει τα προβιοτικά ως «ζωντανούς μικροοργανισμούς οι οποίοι, όταν χορηγούνται σε κατάλληλη ποσότητα, προσφέρουν θετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή» (FAO/WHO, 2002). Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται πιο συχνά ως προβιοτικοί είναι κυρίως οξυγαλακτικά βακτήρια, του γένους Lactobacillus, και Bifidobacterium, καθώς επίσης και στελέχη του γένους Enterococcus. Κάθε νέο στέλεχος που απομονώνεται, θα πρέπει να διαθέτει ορισμένα χαρακτηριστικά. Αρχικά, λόγω του ότι ενσωματώνεται στα τρόφιμα, θα πρέπει να μπορεί να επιβιώσει κατά το πέρασμα του από το γαστρεντερικό σωλήνα, και ειδικότερα να ανταπεξέλθει στις όξινες συνθήκες του στομάχου και στη δράση πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως είναι οι πεψίνες και οι παγκρεατίνες. Η ικανότητα προσκόλλησης είναι επίσης, μια ιδιότητα μέσω της οποίας παρατείνεται η παρουσία και η δράση των προβιοτικών στο γαστρεντερικό σωλήνα, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερο χρόνο αλληλεπίδρασης τους με τον ξενιστή. Ωστόσο, δεν αποτελεί προαπαιτούμενο της δράσης τους. Επίσης, κάθε νέο εν δυνάμει προβιοτικό στέλεχος που απομονώνεται, είναι απαραίτητο να μην είναι παθογόνο και να διαθέτει αντι-μικροβιακή δράση έναντι παθογόνων μικροοργανισμών (Mercenier et al., 2008). Υπάρχουν πολλές μελέτες που καταδεικνύουν τα οφέλη των προβιοτικών σε παθολογικές καταστάσεις του γαστρεντερικού συστήματος, όπως για παράδειγμα στην ιδιοπαθή φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και το σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου (irritable bowel syndrome – IBS). Επίσης, αυξάνονται τα τελευταία χρόνια οι μελέτες που αποδεικνύουν την ευεργετική δράση των προβιοτικών και σε διαταραχές άλλων συστημάτων, όπως είναι διαταραχές του μεταβολισμού, ανοσολογικές διαταραχές ή διαταραχές του ψυχισμού του ατόμου. Παράλληλα, μετά από in vitro και in vivo έρευνες έχει παρατηρηθεί μείωση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μετά από επίδραση με προβιοτικούς μικροοργανισμούς (Tiptiri-Kourpeti et al., 2016), καθώς επίσης και άλλων μορφών καρκινικών κυττάρων όπως για παράδειγμα καρκινικά κύτταρα μαστού (Marschalek et al., 2017). Οι μηχανισμοί με τους οποίους δρουν οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι ειδικοί για το κάθε στέλεχος και καθορίζουν την αποτελεσματικότητα τους και τις ευεργετικές τους επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι η ενίσχυση του επιθηλιακού φραγμού, η προσκόλληση στον εντερικό βλεννογόνο, ο ανταγωνιστικός αποκλεισμός παθογόνων μικροβίων, η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και η τροποποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή (Bermudez-Brito et al., 2012).Τα τελευταία χρόνια υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για την απομόνωση νέων προβιοτικών μικροοργανισμών και την εφαρμογή τους στην ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων. Στο πλαίσιο αυτό, η ερευνητική μας ομάδα, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υγιεινής, του Τμήματος Αγροτικής Ανάπτυξης του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης, αρχικά απομόνωσε νέα οξυγαλακτικά βακτήρια από γαλακτοκομικό προϊόν τύπου φέτα, και μελέτησε το προβιοτικό τους δυναμικό μέσω καθιερωμένων in vitro δοκιμασιών, συμπεριλαμβανομένων της αντίστασης στο χαμηλό pH, της αντίστασης σε πεψίνη και παγκρεατίνη, καθώς και της αντοχής στη δράση χολικών αλάτων. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε έλεγχος ασφάλειας μέσω της μελέτης ανθεκτικότητας έναντι κοινά χρησιμοποιούμενων αντιβιοτικών. Το στέλεχος Lactobacillus Κ5, το οποίο εμφάνισε τις καλύτερες προβιοτικές ιδιότητες, επιλέχθηκε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής να ταυτοποιηθεί μοριακά, να μελετηθεί περαιτέρω ως προς το προβιοτικό του δυναμικό και να χαρακτηριστούν οι μηχανισμοί δράσης του, εφαρμόζοντας τόσο in vitro όσο και in vivo πειραματικά μοντέλα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μοριακή ταυτοποίηση και αποδείχθηκε ότι το εν λόγω στέλεχος ανήκει στο είδος paracasei. Παράλληλα αναπτύχθηκε μια αντίδραση PCR για την ανίχνευση του στελέχους σε τρόφιμα, με τη χρήση στελεχο-ειδικών εκκινητών οι οποίοι σχεδιάστηκαν με την τεχνική ανάλυσης τυχαία ενισχυμένου πολυμορφικού DNA (RAPD - Random amplified polymorphic DNA). Ακολούθησε στη συνέχεια, μελέτη των μηχανισμών δράσης του συγκεκριμένου στελέχους in vitro. Πιο συγκεκριμένα, μέσω ποσοτικής ανάλυσης και συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού, μελετήθηκε η προσκολλητική ικανότητα του L. paracasei K5 στην καρκινική σειρά εντερικών επιθηλιακών κυττάρων Caco-2. Το στέλεχος L. paracasei K5 εμφάνισε σημαντική ικανότητα προσκόλλησης στα καρκινικά κύτταρα, η οποία ήταν παρόμοια με τα στελέχη αναφοράς L. casei ATCC 393 και L. rhamnosus GG, δύο εμπορικά διαθέσιμα προβιοτικά στελέχη. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η πιθανή αντι-πολλαπλασιαστική του δράση και αποδείχθηκε ότι μετά από επίδραση με το συγκεκριμένο στέλεχος παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων με δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενο τρόπο. Η παρατηρούμενη ανασταλτική επίδραση του L. paracasei K5 έναντι των καρκινικών κυττάρων, αποδείχθηκε ότι επάγεται με τη διαδικασία της απόπτωσης μέσω τροποποίησης της γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένων μορίων της οικογένειας Bcl-2 σε επίπεδο mRNA, η οποία επιβεβαιώθηκε και σε επίπεδο πρωτεΐνης. Παράλληλα, αποδείχθηκε η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης του στελέχους έναντι των καρκινικών κυττάρων Caco-2. Στη συνέχεια, θέλοντας να μελετήσουμε τη δράση του συγκεκριμένου στελέχους in vivo, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα. Πιο συγκεκριμένα, με το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα ποντικών, που αποτελεί ένα καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο φλεγμονής, διερευνήθηκε η ανοσορρυθμιστική ικανότητα του L. paracasei K5. Στα ποντίκια τα οποία δέχθηκαν επίδραση με το προβιοτικό στέλεχος παρατηρήθηκε αυξημένη στρατολόγηση κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, η οποία ήταν 8 φορές μεγαλύτερη συγκριτικά με τα ποντίκια αναφοράς. Η ανάλυση του εξιδρώματος των ραχιαίων αεροθυλάκων αποκάλυψε μια σημαντική τροποποίηση της έκφρασης διαφόρων προ-φλεγμονωδών παραγόντων στην περιοχή. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης συγκεκριμένων κυτοκινών και χημειοκινών (IL-1α, ΙL-1β, IL-6, TNF-α – tumor necrosis factor-alpha, C-X-C motif ligand 2 – CXCL2), καθώς επίσης και διαλυτών μεσολαβητών φλεγμονής (intercellular adhesion molecule – sICAM και metallopeptidase inhibitor-1 –TIMP-1). Παράλληλα, μελετήθηκαν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υποδοχέων TLRs – Toll-like receptors, με την τεχνική της PCR πραγματικού χρόνου μετά από επίδραση με το στέλεχος L. paracasei K5 στα κύτταρα Caco-2. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε παροδική επαγωγή της έκφρασης των TLR2, 4, 6, και 9. Συνοψίζοντας, στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας μελετήθηκε εκτενώς ένα νέο οξυγαλακτικό βακτηρίο ως προς το προβιοτικό του δυναμικό, τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo πειραματικά μοντέλα. Αποδείχθηκε ότι το στέλεχος Lactobacillus paracasei Κ5 παρουσιάζει σημαντικές προβιοτικές ιδιότητες και μπορεί μελλοντικά να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων.