Διερεύνηση της εξέλιξης των εξειδικεύσεων των διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών

Abstract

The bacterial purine-pyrimidine transporters are divided in two families, namely NCS1 and NAT/NCS2, whose members are not functionally related with their human homologues. The family NAT/NCS2 is divided in two homology clusters represented by permeases for uracil and xanthine and/or uric acid (cluster of NAT/COG2233) and for hypoxanthine, guanine and/or adenine (cluster of AzgA-like/COG2252), respectively. To date, the AzgA-like members are not well studied and their structure is not yet crystallographically resolved. However, the functionally characterized homologues AdeP and GhxP of E. coli Κ-12 share two interesting features: a) high sequence identity with similar key binding site determinants, but strict distinction in their specificity profiles for adenine or hypoxanthine/guanine respectively, and b) high affinity for known antimetabolite drugs that are used for decades in medical practice as anticancer agents or immunosuppressants. In the present study, we aimed to map the distinct specificity profiles of AzgA-like transporters and delineate the different molecular characteristics of AdeP and GhxP, in order to determine amino acid residues that are involved in the specificity split. To this end, we based our research in: a) phylogenetic analysis and sequence motif discovery in AzgA-like cluster, b) rationally designed mutagenesis in AdeP and GhxP according to our phylogenetic analysis, c) analysis of the specificity profiles of wild type transporters and their mutants using adenine/guanine based analogues, in order to elucidate the range of the specificity split and d) use of adenine/guanine based antimetabolites as in vivo toxicity agents in E. coli Κ-12. Our phylogenetic analysis revealed that the specificity split between AdeP and GhxP, is present in symbiotic members of γ-Proteobacteria and mainly in those of the gut of metazoan (orders Enterobacterales, Pasteurellales and Aeromonadales). AdeP and GhxP form two distinct clades, representing homologues for the uptake of adenine or hypoxantine/guanine, respectively. To get insight into the correlation between sequence and function in AzgA-like transporters, we performed in silico analysis to identify putative sequence motifs of transporter homologues in Proteobacteria. The detected sequence motifs mainly include the highly conserved and critical for function binding site residues in AdeP and GhxP, which were functionally characterized in previous studies (Papakostas, Botou, and Frillingos (2013), J. Biol. Chem. 288, 36827-36840). By comparing the motifs between AdeP and GhxP clades, we observed a distinct conservation pattern of amino acid residues in close proximity or distant from the binding site. These differences could relate to their distinct specificity profiles. To pinpoint strongly conserved amino acid differences between homologues of AdeP and GhxP clades, we reconstructed ancestral sequences for each clade (AncAdeP/AncGhxP). Comparing the motif regions of the two ancestral sequences, we detected sites with different amino acid residues. Based on the above findings, we rationally designed a mutagenesis approach to study the specificity split between AdeP and GhxP. Initially, AdeP was subjected to site-directed mutagenesis at all targeted sites, and substitutions that led in severe alteration of the specificity profile, were subsequently applied to GhxP (with the corresponding substitutions in each case). Mutagenesis analysis in AdeP revealed 12 sites, where the inserted substitutions maintain adenine activity, while affecting the specificity profile of the wild type. AdeP mutants were divided in three groups according to the resulting specificity changes: a) AdeP_N49V, G93S and N95T, of the periplasmic edges of transmembrane segments (TMs) 1 and 3, which modify the specificity profile by reducing affinity for AdeP substrates and increasing affinity for GhxP substrates, b) AdeP_I45S, M92I and S268A, in close proximity to the binding site, which severely reduce affinity for purine analogs, c) AdeP_R145A, A315V, S320A, S321A, S324A and V325A, of the cytoplasmic edges of TMs 5 and 10, which broaden the specificity profile, by preserving high affinity for AdeP substrates (adenine, 2,6diaminopurine, purine) while gaining high affinity for some GhxP substrates as well (hypoxanthine, 6-mercaptopurine, but not guanine or 6-thioguanine). Most surprisingly, AdeP_R145A shows the ability to transport hypoxanthine with high affinity (KΜ levels similar to wild type GhxP) The corresponding sites were also subjected to mutagenesis in GhxP background. Neither of the GhxP mutants was found to alter the specificity profile of the wild type, while substitutions led either to loss of function (V46N, C87P, T92N, P316S/V319A), or loss of guanine activity (S90G, I89M/S90G, A324S/A325S), or in one case, loss of hypoxanthine activity (V319A). In all cases, we did not observed significant changes in affinity of physiological substrates or analogues from the ligand binding assays (the mutants that show loss of activity for either substrates, recognize with high affinity the substrate that they do not transport). In addition, neither of the GhxP mutants showed recognition or transport of adenine or any of its analogues. Our results reveal that substitutions at the periphery of the binding site or at distant positions, may affect the specificity profile, but may also function differently between AdeP and GhxP. The residues found in AdeP. strongly recommend the existence of structural regions and specific molecular filters for substrate selection in their translocation pathway. Mutagenesis analysis in AdeP and GhxP respectively, showed that the strict specificity split can be relaxed for hypoxanthine but not for guanine. To pinpoint differences in substrate preferences and in residues that might relate to adenine-guanine selectivity, we studied in Ε. coli, the adenine/guanine/hypoxanthine transporter Q92VC3 of S. meliloti and we compared its specificity profile along with its sequence with the closely related transporters, AdeP and GhxP (wild type and mutants). The transporter, Q92VC3, showed broad specificity profile, recognizing purine analogues which are also recognized by AdeP and GhxP. In addition, Q92VC3 recognizes, with high affinity, substrates that are not recognized by AdeP or GhxP, such as cytokine analogues (adenine analogues with substitutions in C6-NH2) which might relate to regulation of the plant-rhizobium interaction for the formation of symbiotic nodules. AzgA-like transporters show high affinity for antimetabolite drugs, thus underlying the biological significance of its bacterial homologues. Antimetabolites can also function as bacteriotoxic agents with minor side effects to the host organism, by specifically targeting AzgA-like transporters that are not conserved in humans. Thereby, we tested all analogues/antimetabolites that are recognized with high affinity by AdeP or GhxP, for their toxicity in Ε. coli K-12. According to the developed methodology, the only analogue with inhibitory effect in growth of Ε. coli was 2-fluoroadenine. Despite the fact that other known toxic antimetabolites have been associated with GhxP function, our results revealed 2-fluoroadenine as the first toxic compound to be associated with AdeP function.

Οι μεταφορείς πουρινών-πυριμιδινών των βακτηρίων κατανέμονται σε δύο οικογένειες, τις NCS1 και NAT/NCS2, στις οποίες τα ομόλογα του ανθρώπου εμφανίζουν διαφορετική εξειδίκευση. Ειδικότερα, η οικογένεια NAT/NCS2 χωρίζεται σε δύο φυλογενετικά υποσύνολα, τα οποία αντιπροσωπεύονται από μεταφορείς ουρακίλης και ξανθίνης και/ή ουρικού (ομάδα NAT/COG2233) και μεταφορείς υποξανθίνης, γουανίνης και/ή αδενίνης (ομάδα AzgA-like/COG2252), αντίστοιχα. Μέχρι σήμερα η ομάδα AzgA-like δεν έχει μελετηθεί εκτενώς και δεν έχει αναλυθεί κρυσταλλογραφικά η δομή κάποιου μέλους της. Ωστόσο, τα λειτουργικώς γνωστά ομόλογα AdeP και GhxP της E. coli Κ-12, εμφανίζουν δύο ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά: α) υψηλή ταυτότητα αλληλουχίας με μεγάλη ομοιότητα στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης, αλλά αυστηρά διακριτές εξειδικεύσεις για την μεταφορά αδενίνης ή υποξανθίνης/γουανίνης αντίστοιχα και β) υψηλή συγγένεια για κλασσικούς αντιμεταβολίτες που χρησιμοποιούνται στην ιατρική πρακτική ως αντικαρκινικά ή ανοσοκατασταλτικά φάρμακα εδώ και πολλές δεκαετίες. Στόχος της διατριβής ήταν να χαρτογραφήσουμε τα διαφορετικά προφίλ εξειδίκευσης των AzgA-like μεταφορέων και να διερευνήσουμε την μοριακή βάση της διάκρισης εξειδικεύσεων των AdeP και GhxP, καταλήγοντας στον εντοπισμό αμινοξέων της αλληλουχίας τους που πιθανώς ελέγχουν την εξειδίκευση. Η στρατηγική που ακολουθήσαμε στηρίζεται σε α) φυλογενετική ανάλυση και ανάλυση μοτίβων αλληλουχίας της AzgA-like, β) ανάλυση μεταλλαξιγένεσης στους AdeP και GhxP για συγκεκριμένες θέσεις όπως υποδεικνύονται από την φυλογενετική ανάλυση, γ) ανάλυση του προφίλ εξειδίκευσης φυσικών μεταφορέων και των μεταλλαγμάτων τους με μια σειρά αναλόγων αδενίνης/γουανίνης ώστε να διερευνηθεί το εύρος των διαφορών εξειδίκευσης και δ) μελέτη της επίδρασης αντιμεταβολιτών με βάση τις αδενίνη/γουανίνη σε πειράματα κυτταροτοξικότητας in vivo. Από την φυλογενετική ανάλυση προέκυψε ότι η διατήρηση δύο τουλάχιστον ομολόγων με διακριτές εξειδικεύσεις αντίστοιχων των AdeP και GhxP, εντοπίζεται κατά βάση σε γ-Πρωτεοβακτήρια συμβιωτικών οικογενειών και κυρίως του εντέρου μεταζώων (τάξεις Enterobacterales, Pasteurellales και Aeromonadales). Οι μεταφορείς AdeP και GhxP διαχωρίζονται φυλογενετικά σχηματίζοντας δύο διακριτούς κλάδους ομολόγων που φαίνεται να σχετίζονται με την μεταφορά αδενίνης ή υποξανθίνης/γουανίνης αντίστοιχα. Για να εξετάσουμε την ενδεχόμενη συσχέτιση συγκεκριμένων περιοχών της αλληλουχίας με την λειτουργία των AzgA-like μεταφορέων, εντοπίσαμε με πληροφορική ανάλυση χαρακτηριστικά μοτίβα αλληλουχίας μεταξύ των ομολόγων από όλα τα Πρωτεοβακτήρια. Στα μοτίβα αλληλουχίας περιλαμβάνονται καταρχήν όλες οι απόλυτα συντηρημένες θέσεις αμινοξέων του προβλεπόμενου κέντρου δέσμευσης των AdeP και GhxP, οι οποίες είχαν μελετηθεί λειτουργικά σε προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου (Papakostas, Botou, and Frillingos, 2013, J. Biol. Chem. 288, 36827-36840). Παρατηρήσαμε επίσης, ότι εντός των μοτίβων αλλά σε περιφερειακές ή απομακρυσμένες από το κέντρο δέσμευσης θέσεις, συντηρούνται αμινοξέα διαφορετικού χαρακτήρα πλευρικής ομάδας μεταξύ των κλάδων των AdeP και GhxP. Είναι πιθανό αυτές οι διαφορές να δικαιολογούν την διάκριση των εξειδικεύσεων τους. Για να εντοπιστούν οι ισχυρά συντηρημένες θέσεις διαφορών ανάμεσα στα ομόλογα του AdeP και στα ομόλογα του GhxP, έγινε εξαγωγή και ανάλυση της αλληλουχίας των προγονικών αλληλουχιών του κάθε κλάδου (AncAdeP/AncGhxP). Οι θέσεις διαφορών αμινοξέων που εντοπίστηκαν από την σύγκριση των προγονικών αλληλουχιών στις περιοχές των μοτίβων, αποτέλεσαν τους στόχους μεταλλαξιγένεσης της παρούσας διατριβής στους AdeP και GhxP. Αρχικά, έγινε μεταλλαξιγένεση σε όλες τις θέσεις-στόχους στον AdeP και στην συνέχεια, οι θέσεις μεταλλαγών που εμφάνισαν σημαντικές λειτουργικές επιπτώσεις στον AdeP, αντικαταστάθηκαν και στον GhxP (με την αντίστροφη αλλαγή σε κάθε περίπτωση). Η μεταλλαξιγένεση στον AdeP αποκάλυψε δώδεκα θέσεις της αλληλουχίας, όπου οι αντικαταστάσεις που εισήχθησαν δεν επηρεάζουν σημαντικά την ενεργότητα αδενίνης, αλλά τροποποιούν το προφίλ εξειδίκευσης του φυσικού τύπου. Τα μεταλλάγματα αυτά διακρίνονται σε τρείς κατηγορίες ανάλογα με την αλλαγή που επιφέρουν στην εξειδίκευση: α) τα N49V, G93S και N95T στην περιπλασματική πλευρά των διαμεμβρανικών τμημάτων (ΤΜs) 1 και 3 εμφανίζουν μειωμένη συγγένεια για υποστρώματα που αναγνωρίζει ο φυσικού τύπου AdeP (όπως πουρίνη, 2,6-διαμινοπουρίνη) αλλά αυξημένη για υποστρώματα του GhxP (κυρίως υποξανθίνη, 6-μερκαπτοπουρίνη, αλλά και γουανίνη), β) τα I45S, M92I και S268A περιμετρικά του κέντρου δέσμευσης μειώνουν την συγγένεια για όλα τα ανάλογα πουρινών που εξετάσθηκαν, γ) τα R145A, A315V, S320A, S321A, S324A και V325A στην κυτταροπλασματική πλευρά των ΤΜs 5 και 10 φαίνεται να διευρύνουν το προφίλ εξειδίκευσης, καθώς διατηρούν την υψηλή συγγένεια για τα υποστρώματα που αναγνωρίζει ο φυσικού τύπου AdeP (αδενίνη, 2,6-διαμινοπουρίνη, πουρίνη) αλλά εμφανίζουν σημαντική συγγένεια και για ορισμένα από τα υποστρώματα του GhxP (υποξανθίνη, 6-μερκαπτοπουρίνη, αλλά όχι γουανίνη ή 6-θειογουανίνη), ενώ επιπλέον, το μετάλλαγμα AdeP_R145A (και το διπλό R145A/V146H) εμφανίζει την ιδιότητα να μεταφέρει και υποξανθίνη με πολύ υψηλή συγγένεια (KΜ στα επίπεδα του φυσικού τύπου GhxP). Στις αντίστοιχες θέσεις έγινε μεταλλαξιγένεση και στο υπόβαθρο του GhxP. Στον GhxP οι αντικαταστάσεις που εισήχθησαν οδήγησαν είτε σε πλήρη απώλεια της λειτουργίας με οποιοδήποτε υπόστρωμα (V46N, C87P, T92N, P316S/V319A) είτε σε απώλεια ενεργότητας ειδικά για την γουανίνη (S90G, I89M/S90G, A324S/A325S) είτε, σε μία περίπτωση (V319A), απώλεια ενεργότητας ειδικά για την υποξανθίνη. Σε όλες τις περιπτώσεις δεν ανιχνεύτηκαν σημαντικές αλλαγές στις συγγένειες αναγνώρισης των φυσικού τύπου υποστρωμάτων ή αναλόγων, από τα πειράματα ανταγωνισμού (τα μεταλλάγματα που μεταφέρουν μόνο το ένα από τα δύο υποστρώματα αναγνωρίζουν με υψηλή συγγένεια ακόμη και το υπόστρωμα που δεν μεταφέρουν). Κανένα από τα μεταλλάγματα του GhxP δεν εμφάνισε ικανότητα αναγνώρισης ή μεταφοράς αδενίνης ή αναλόγων της. Τα αποτελέσματα φανερώνουν ότι οι αντικαταστάσεις περιφερειακά του κέντρου δέσμευσης, αλλά και σε πιο απομακρυσμένες θέσεις, μπορεί να έχουν σημαντική επίπτωση στο προφίλ εξειδίκευσης, αλλά μεταξύ των AdeP και GhxP πιθανώς να λειτουργούν με διαφορετικό τρόπο. Οι θέσεις που εντοπίστηκαν στον AdeP ενισχύουν τα δεδομένα για την ύπαρξη δομικών περιοχών αλλά και ειδικών μοριακών “φίλτρων” που εμπλέκονται στην διαλογή των υποστρωμάτων κατά την πορεία μεταφοράς τους. Η ανάλυση της μεταλλαξιγένεσης στους AdeP και GhxP έδειξε ότι η αυστηρή διάκριση της εξειδίκευσης χαλαρώνει μόνο για την υποξανθίνη, ενώ δεν επιτεύχθηκε η άρση της διάκρισης μεταξύ αδενίνης και γουανίνης με κανένα από τα μεταλλάγματα. Για την εντόπιση διαφορών στην προτίμηση αναλόγων καθώς και διαφορών σε θέσεις της αλληλουχίας που πιθανά συνδέονται με την αναγνώριση αδενίνης-γουανίνης, μελετήθηκε εκτενώς στην E. coli, ο μεταφορέας αδενίνης/γουανίνης/υποξανθίνης Q92VC3 του S. meliloti και συγκρίθηκε το προφίλ εξειδίκευσης και η αλληλουχία του με τους συγγενικούς AdeP και GhxP καθώς και με τα μεταλλάγματα τους. Ο Q92VC3 βρέθηκε ότι παρουσιάζει ευρεία εξειδίκευση, περιλαμβάνοντας μεταξύ των υποστρωμάτων του ανάλογα πουρινών που αναγνωρίζονται τόσο από τον AdeP όσο και από τον GhxP. Επιπρόσθετα, ο Q92VC3 βρέθηκε να αναγνωρίζει και ανάλογα που δεν αναγνωρίζονται ούτε από τον AdeP ούτε από τον GhxP, όπως ορισμένες κυτοκινίνες (ανάλογα αδενίνης με υποκατεστημένη την αμινομάδα στη θέση 6) οι οποίες πιθανόν να σχετίζονται με την ρύθμιση της αλληλεπίδρασης φυτού-ριζοβίου για τον σχηματισμό φυματίων. Η υψηλή συγγένεια των μεταφορέων της AzgA-like για αντιμεταβολίτες αναδεικνύει την σημασία της μελέτης των βακτηριακών ομολόγων της οικογένειας αυτής. Οι αντιμεταβολίτες θα μπορούσαν να λειτουργήσουν και ως βακτηριοτοξικά φάρμακα με μειωμένες παρενέργειες στον ξενιστή λόγω της δυνατότητας ειδικής στόχευσης των AzgA-like μεταφορέων που δεν έχουν ομόλογα στον άνθρωπο. Στα πλαίσια της διατριβής, ελέγξαμε όλα τα πουρινικά ανάλογα/αντιμεταβολίτες για τα οποία εμφανίζουν υψηλή συγγένεια οι AdeP και GhxP, για πιθανή βακτηριοτοξική δράση τους στην E. coli K-12. Στις συνθήκες που μελετήθηκαν, το μόνο ανάλογο που παρουσίασε αναστολή της αύξησης της E. coli ήταν η 2-φθοροαδενίνη. Αν και η κυτταροτοξικότητα άλλων αντιμεταβολιτών στην E. coli είχε ήδη συσχετιστεί με την λειτουργία του GhxP, η 2-φθοροαδενίνη είναι το πρώτο κυτταροτοξικό ανάλογο/αντιμεταβολίτης που συνδέεται από τα πειράματά μας με την λειτουργία του AdeP.