Συμπεριφορά και παρεμπόδιση του Listeria monocytogenes κατά την επεξεργασία και συντήρηση φιλέτων καπνιστής πέστροφας

Abstract

Fishery products represent one of the most important agricultural products that Greece produces. Seafood is perishable due to their high nutritional value and can be contaminated with pathogenic micro-organisms at various stages of their production chain, from the environment, humans, equipment and treatment areas, making them dangerous for consumption. L. monocytogenes is a ubiquitous Gram-positive, foodborne pathogenic bacterium that can be found in a wide range of foods and can survive under various treatments (freezing, salting, heat treatment). It is estimated that the main source of contamination is mildly processed ready-to-eat foods (RTE). Many categories of food and fishery products have been epidemiologically associated with sporadic cases of listeriosis. Hot smoked trout fillets belong to mild heat-treated ready-to-eat foods that can support the growth of L. monocytogenes and have been the main subject of study of the current PhD thesis. In particular, the present PhD thesis focuses on the fate and inhibition of L. monocytogenes during processing and storage of hot smoked trout fillets. Initially, it was investigated the antimicrobial effect of nine (9) water-soluble liquid smoke condensates against L. monocytogenes. An assessment of the minimum inhibitory (MIC) and bactericidal concentration (MBC) of liquid smoke performed against control cells, biofilm cells, and osmotically adapted cells of L. monocytogenes. The most effective liquid smoke, coded as L9, had a strong inhibitory (MIC) and bactericidal effect (MBC) of 0.25 % and 0.50 % (v/v), respectively for both studied temperatures (7.9 and 37 oC), with slight differences between the different cells studied. The MIC value for the second most effective liquid smoke G6, was 0.25 % (v/v) at 7.9 oC, while in all other cases it was more than 2.00 % (v/v), against control, osmotically adapted and biofilm cells of L. monocytogenes. Subsequently, it was investigated the thermotolerance of healthy (control) and osmotically adapted (10.00 %, w/v, NaCl) L. monocytogenes cells, which were subjected to thermal stress at 60 oC for 20 min. To appraise the osmotic adaptation, the cells inoculated in preheated TSBy.e. (60 oC) as heating menstruum, containing: i) 0.50 % NaCl ii) 5.00 % NaCl and iii) 10.00 % (w/v) NaCl, in combination with heating at 60 oC for 20 min, in a water bath. Results showed that the thermal resistance of L. monocytogenes was significantly affected by previous osmotic adaptation of the cells. D60oC values determined by linear regression of osmotically adapted L. monocytogenes cells, were 10.08 ± 1.41, 14.27 ± 1.66, and 8.28 ± 1.89 min after heating in TSBy.e. with 0.50 %, 5.00 % and 10.00 % (w/v) NaCl. Furthermore, we assessed the heat stress of biofilm cells. To assess the heat sensitivity and sublethal injury, inoculums of L. monocytogenes planktonic and biofilm cells were challenged in preheated TSBy.e., immersed in a water bath with constant temperature at 60 oC. D60oC values for L. monocytogenes biofilm and planktonic cells, were 6.21 and 4.85 min, respectively, showing that biofilm cells were more heat resistant in contrasted to planktonic cells. The surviving L. monocytogenes cells were enumerated by surface plating on Tryptone Soy Agar with 0.6 % (w/v) Yeast Extract (TSAye). L. monocytogenes cells were also plated on PALCAM agar and TSAy.e. supplemented with 5.00 % NaCl (w/v), as another selective medium, to assess the injury. The counts of the osmotically adapted cells of L. monocytogenes were higher than healthy cells in all cases after enumeration on the selective media. At the same time, this difference increased as the time of exposure of the cells to the thermal treatment (60 oC) increased. Generally, biofilm cells enumerated on TSAy.e. + NaCl, exhibited higher heat resistance than planktonic cells, while the opposite was found for the cells enumerated on PALCAM agar.Following, investigated the effectiveness of liquid smoke fractions (L9 or G6), embedded in TSA y.e. 0.6 % in concentrations ranging from 0.25 % to 1.00 % in 0.25 % increments, to investigate the sensitivity of L. monocytogenes in liquid smokes after stresses such as a) thermal stress of planktonic and biofilm cells and b) subsequent osmotic (10.00 %, w/v NaCl) and thermal stress (60 oC). After heat treatment, a small amount (≥ 0.50 %, v/v) of the most effective liquid smoke L9, resulted in a reduction under the detection limit of 2.00 log CFU/mL for the osmotically adapted and healthy (no stress) cells with or without heat treatment (60 oC). Interestingly, the resistance of L. monocytogenes biofilm cells after heat treatment at 60 oC, increased significantly against 0.25 % and 0.50 % (v/v) L9, showing a reduction of 0.09 and 0.51 log CFU/mL, respectively. L. monocytogenes cells did not reveal different resistance against liquid smoke G6 in all concentrations used. Overall, heat-treated biofilm cells showed higher resistance to the antimicrobial effect of liquid smoke. In the next stage, the exploration of dominant spoilage microorganisms of hot smoked vacuum-packed rainbow trout fillets from two fish processing industries (regions A and B) in Greece during storage at 2.0 and 7.9 oC was carried out. The organoleptic examination at 7.9 oC, showed that the fillets were spoiled after 70 and 63 days from region A and B, respectively, while at 2.0 oC even after 150 days of storage the total viable counts (TVC) of the fillets from both regions were under 7-log CFU/g but rejected after 135 days due to sensory changes. The most dominant spoilage group of microorganisms that prevailed (based on cultivation techniques) at both temperatures and regions were the Gram-positive lactic acid bacteria (LAB). After the enumeration of the microorganisms in several culture media, the colonies (>50% from each plate), from five-time point interval, grown on MRS culture medium of pH 5.4, 6.4 and 7.4 were obtained and identified using MALDI-TOF MS. Candida zeylanoides (particularly at 2 oC), and Lactobacillus sakei (particularly at 7.9 oC) were the most abundant microorganisms in fish from the industry A, while other bacteria of the genera Candida (C. famata, C. guilliermondii), Lactobacillus (L. curvatus) and Enterococcus (E. faecalis) were also found in fish from the industry B. Differences in abundances and/or bacterial species were observed among MRS media of pH 5.4, 6.4 and 7.4. Subsequently, we studied the interactions that may occur between the dominant spoilage microflora of hot smoked trout fillets and the planktonic and biofilm cells of L. monocytogenes. The competition of planktonic and biofilm L. monocytogenes cells was tested on the surface of a model fish substrate and real hot smoked tout fillets, stored at 4.0 and 7.9 oC. The LAB dominated on the surface of the fillets and surpassed on growth the planktonic L. monocytogenes cells, reaching in population 7.57 και 7.54 log CFU/g, after 60 days of storage at 4.0 and 7.9 oC, respectively. The same results observed on the presence of biofilm cells on the surface of the fillets, stored at 4.0 and 7.9 oC. In all cases, when L. monocytogenes (planktonic and biofilm) cells cultivated on multi-cultures with the mix of the four dominant microorganisms on fish models, the growth of the pathogen was limited. Thus, it appeared that the co-culture of planktonic L. monocytogenes cells with each dominant bacterium separately, at 4.0 oC on fish models, showed a symbiotic interaction, while at 7.9 oC co-cultured microorganisms, limited from the presence of L. monocytogenes. The opposite effect observed in the co-culture of L. monocytogenes biofilm cells with the dominant spoilage microorganisms, with the only exception at 7.9 oC, where the growth of the biofilm cells restricted in the presence of C. famata or C. zeylanoides. Finally, High Hydrostatic Pressure (HHP; 200 MPa for 15 min), liquid smoke (0.50 %, v/v), and freezing (-80 oC) was used to eliminate Listeria monocytogenes in BHI broth, raw and smoked trout. The bactericidal effect of liquid smoke (L9 and G6) solutions, HHP, and their combinations were evaluated against L. monocytogenes LO28, EGD-e and 10403S and further continued with the most resistant strain (10403S) to the combined treatment and G6 was the most effective liquid smoke extract. For the first time, a synergistic effect of liquid smoke, and HHP was observed and further enhanced by freezing prior to HHP. Listeria monocytogenes population in BHI broth (without the addition of NaCl), exposed to L9 or G6 was reduced about 3.23 and 2.90 log CFU/mL, respectively. The effect of HHP and liquid smoke on L. monocytogenes 10403S, prior to freezing was highest in BHI compared to raw and smoked trout. However, a major synergistic effect of HHP, liquid smoke and freezing was observed, reaching a 5.48 log CFU/g reduction when smoked trout was used. High levels of injury also occurred, among the treatments on L. monocytogenes 10403S. Overall, the results of the current PhD thesis showed that the osmotically adapted L. monocytogenes cells revealed increased resistance to heat treatment, as did biofilm cells, compared to planktonic cells. However, following the subsequent hurdle of liquid smoke, only the biofilm cells of the pathogen showed resistance (after heat treatment) against the most effective liquid smoke (L9). In the presence of possible specific spoilage organisms isolated from smoked trout fillets, L. monocytogenes cells (planktonic or biofilm) in some cases have prevailed while in others were not, or exhibited symbiotic behavior. The above shows the importance to investigate the behavior of the physically presented microflora. Finally, a significant synergistic effect was observed of HHP, liquid smoke extracts (L9 or G6) and freezing at –80 oC, when applied on smoked trout fillets, resulting in a significant reduction of the more resistant strain of L. monocytogenes.

Από τα σημαντικότερα αγροτικά προϊόντα που παράγει η Ελλάδα είναι τα αλιευτικά προϊόντα. Πρόκειται για τρόφιμα ευαλλοίωτα λόγω της υψηλής τους περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά που είναι δυνατό να επιμολυνθούν με παθογόνους μικροοργανισμούς σε διάφορα στάδια της παραγωγικής τους αλυσίδας από το περιβάλλον, τον άνθρωπο, τον εξοπλισμό και τους χώρους επεξεργασίας με αποτέλεσμα να καταστούν επικίνδυνα. Το L. monocytogenes, είναι ένα τροφιμογενές παθογόνο βακτήριο και μπορεί να απαντάται σε μια ευρεία γκάμα τροφίμων, επιβιώνει των διάφορων επεξεργασιών (κατάψυξη, αλάτιση, θερμική επεξεργασία) έχοντας ως κυριότερη πηγή τα ήπια επεξεργασμένα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα (RTE). Πολλές κατηγορίες τροφίμων και αλιευτικών προϊόντων έχουν συσχετιστεί επιδημιολογικά με σποραδικές περιπτώσεις λιστερίωσης. Τα φιλέτα καπνιστής πέστροφας (θερμής κάπνισης), ανήκουν στα ήπια θερμικώς επεξεργασμένα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα τα οποία μπορούν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη του L. monocytogenes και αποτέλεσαν το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Συγκεκριμένα, αφορά τη μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας και συντήρησης στη συμπεριφορά του L. monocytogenes στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας. Αρχικά, έγινε διερεύνηση της επίδρασης της αντιμικροβιακής δράσης εννέα (9) υδατοδιαλυτών συμπυκνωμάτων υγρών καπνών στο L. monocytogenes. Έγινε εκτίμηση της ελάχιστης παρεμποδιστικής (MIC) και βακτηριοκτόνου συγκέντρωσης (MBC) των υγρών καπνών, έναντι κανονικών κυττάρων (ελέγχου), κυττάρων βιοϋμενίων και ωσμωτικά προσαρμοσμένων κυττάρων του L. monocytogenes. Ο πιο αποτελεσματικός καπνός, με την κωδική ονομασία L9, είχε ισχυρή παρεμποδιστική (MIC) και βακτηριοκτόνο δράση (MBC) που ήταν 0.25 % και 0.50 % (v/v), αντίστοιχα και για τις δύο μελετώμενες θερμοκρασίες (7.9 και 37 oC), με μικρές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυττάρων που μελετήθηκαν. Η τιμή MIC για το δεύτερο αποτελεσματικότερο καπνό G6, ήταν 0.25 % (v/v) στους 7.9 oC, ενώ σε όλες τις υπόλοιπες περιπτώσεις ήταν > 2.00 % (v/v), όπως και για τα υπόλοιπα συμπυκνώματα υγρών καπνών, έναντι των κανονικών, ωσμωτικά προσαρμοσμένων και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes. Κατόπιν, έγινε έλεγχος της θερμοανθεκτικότητας κανονικών και ωσμωτικά προσαρμοσμένων (10.00 % w/v, NaCl για 12 ώρες) κυττάρων του L. monocytogenes, τα οποία υποβλήθηκαν σε θερμική καταπόνηση στους 60 oC, με ενοφθαλμισμό σε προ θερμασμένο θρεπτικό ζωμό TSBy.e. (60 oC) που περιείχε 0.50 %, 5.00 % και 10.00 % (w/v) NaCl. Ο χρόνος δεκαδικής μείωσης (D60oC) των κανονικών κυττάρων μειώνονταν καθώς αυξάνονταν η αλατότητα του μέσου θέρμανσης. Από την άλλη, τα ωσμωτικά προσαρμοσμένα κύτταρα παρουσίασαν αξιοσημείωτη θερμοαντοχή στους 60 oC, με τιμές D60oC 10.08 ± 1.41, 14.27 ± 1.66 και 8.28 ± 1.89 λεπτά σε μέσο θέρμανσης με 0.50 %, 5.00 % και 10.00 % (w/v) NaCl. Επιπλέον, έγινε έλεγχος της θερμοανθεκτικότητας των κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes, που αναπτύχθηκαν σε μεταλλικές πλάκες από ανοξείδωτο χάλυβα. Τα κύτταρα βιοϋμενίων καθώς και τα πλαγκτονικά κύτταρα του L. monocytogenes λήφθηκαν και υποβλήθηκαν σε θέρμανση στους 60 oC σε TSBy.e. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι ο χρόνος δεκαδικής μείωσης (D60oC) των κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes ήταν 6.29 λεπτά, ενώ για τα πλαγκτονικά κύτταρα ελέγχου ήταν 4.19 λεπτά. Συνεπώς, τα κύτταρα που προήλθαν από βιοϋμένια ήταν πιο θερμοανθεκτικά. Ταυτόχρονα, γίνονταν διερεύνηση των τραυματισμένων κυττάρων του L. monocytogenes μετά τις υποβαλλόμενες καταπονήσεις σε επιλεκτικά υλικά (PALCAM άγαρ και TSAy.e. + NaCl 5.00 %), όπου παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα υποθανάτιου τραυματισμού. Ο αριθμός των ωσμωτικά προσαρμοσμένων κυττάρων του L. monocytogenes ήταν υψηλότερος από τον αντίστοιχο των κανονικών κυττάρων ελέγχου που απαριθμήθηκαν στα επιλεκτικά υλικά σε όλες τις περιπτώσεις και η διαφορά αυξάνονταν καθώς αυξάνονταν και ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων στη θερμική καταπόνηση (60 oC). Τα κύτταρα βιοϋμενίων του L. monocytogenes, που απαριθμήθηκαν σε PALCAM άγαρ και TSAy.e. + NaCl 5.00 %, έφτασαν κάτω από το όριο ανίχνευσης (< 2.00 log CFU/mL) μετά από 1 και 6 λεπτά θερμικής καταπόνησης, αντίστοιχα. Τα κύτταρα βιοϋμενίων μετά από τη θερμική καταπόνηση, παρουσίασαν τη μεγαλύτερη ευαισθησία κατά την απαρίθμηση τους στο PALCAM άγαρ. Συμπυκνώματα υγρών καπνών (L9 και G6), ενσωματώθηκαν στα τρυβλία με TSAy.e σε κατάλληλες συγκεντρώσεις (0.25 % έως 1.00 %, v/v) με στόχο τη διερεύνηση της ευαισθησίας του L. monocytogenes στους υγρούς καπνούς μετά από καταπονήσεις όπως: α) το θερμικό σοκ σε πλαγκτονικά κύτταρα και κύτταρα βιοϋμενίων και β) διαδοχικές καταπονήσεις ωσμωτικού σοκ (10.00 %, w/v NaCl), και θερμικής καταπόνησης (60 oC). Ο υγρός καπνός L9, σε συγκεντρώσεις ≥ 0.50 % (v/v) προκάλεσε μείωση (κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης) του πληθυσμού των κανονικών και ωσμωτικά προσαρμοσμένα κυττάρων του παθογόνου πριν ή και μετά από τη θερμική επεξεργασία, χωρίς να παρουσιάσουν διαφορετική ανθεκτικότητα στην αντιμικροβιακή του δράση. Τα κύτταρα βιοϋμενίων, τα οποία είχαν υποστεί θερμική καταπόνηση στους 60 oC, ήταν πιο ανθεκτικά από τα πλαγκτονικά και μειώθηκαν μόλις 0.09 και 0.51 log CFU/mL παρουσία 0.25 % και 0.50 % (v/v) L9, αντίστοιχα. Η αποτελεσματικότητα του υγρού καπνού G6 ήταν πολύ μικρότερη συγκριτικά με τον L9. Συνεπώς, το διαφορετικό ιστορικό ανάπτυξης των κυττάρων του παθογόνου (ωσμωτικά προσαρμοσμένα, κύτταρα βιοϋμενίων και πλαγκτονικά κύτταρα) συντέλεσε στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στην επίδραση του υγρού καπνού, καθώς τα θερμικώς τραυματισμένα κύτταρα βιοϋμενίων ήταν ανθεκτικότερα. Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών φιλέτων καπνιστής πέστροφας από 2 περιοχές (Α και Β) σε συσκευασία κενού και συντηρούμενων στους 2.0 και 7.9 oC. Από τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής εξέτασης των φιλέτων, προέκυψε ότι στη μη ορθή θερμοκρασία (7.9 oC) συντήρησης, τα φιλέτα απορρίφθηκαν μετά την 70η και 63η ημέρα (από την περιοχή Α και Β, αντίστοιχα), ενώ στους 2.0 οC η ΟΜΧ των φιλέτων ακόμη και μετά από 150 ημέρες και για τις δύο περιοχές δεν ξεπέρασε τους 7.00 log CFU/g αλλά η ημέρα αλλοίωσης, ορίστηκε στις 135 ημέρες. Η κυρίαρχη ομάδα μικροοργανισμών που επικράτησαν (με βάση τις καλλιεργητικές τεχνικές) και στις 2 θερμοκρασίες και περιοχές, ήταν τα οξυγαλακτικά βακτήρια που απαριθμήθηκαν σε MRS με διαφορετικές τιμές pH (5.4, 6.4 και 7.4). Οι αποικίες που απομονώθηκαν, ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση πρωτεωμικής ανάλυσης με MALDI-TOF MS. Από την ταυτοποίηση των αποικιών που απομονώθηκαν από το MRS με τις 3 τιμές pH (5.4, 6.4 και 7.4), προέκυψαν 3 διαφορετικά γένη μικροοργανισμών Συγκεκριμένα, 71 αποικίες ανήκαν στα Enterococcus spp., 383 στα Candida spp. και 113 στα Lactobacillus spp. εκ των οποίων κάποιες ήταν κοινές στα δείγματα των φιλέτων από τις διαφορετικές περιοχές. Στα φιλέτα από την περιοχή Α, εντοπίστηκαν οι μικροοργανισμοί C. zeylanoides και L. sakei. Μεγαλύτερη ποικιλομορφία εμφανίστηκε στα φιλέτα από την περιοχή Β, όπου εντοπίστηκαν οι μικροοργανισμοί, E. faecalis, C. zeylanoides, C. famata, C. guilliermondii, L. sakei και L. curvatus.Κατόπιν έγινε διερεύνηση της ανταγωνιστικής συμπεριφοράς που μπορεί να παρουσιάζεται μεταξύ των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών που απομονώθηκαν και του παθογόνου βακτηρίου L. monocytogenes. Μελετήθηκε ο ανταγωνισμός τους, έναντι πλαγκτονικών και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes, σε πραγματικά φιλέτα καθώς και σε μοντέλα ζωμού καπνιστής πέστροφας (μόνο- και πολυκαλλιέργειες) στους 4.0 και 7.9 oC. Στα φιλέτα, τα οξυγαλακτικά βακτήρια επικράτησαν και δε φάνηκε να επηρεάζεται η ανάπτυξη τους από την παρουσία των πλαγκτονικών κυττάρων του L. monocytogenes και έφτασαν τους 7.57 και 7.54 log CFU/g, έπειτα από 60 ημέρες στους 4.0 και 7.9 oC, αντίστοιχα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην ανάπτυξη των πλαγκτονικών και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes στα φιλέτα, αποθηκευμένα στους 4.0 και 7.9 oC.Σε όλες τις περιπτώσεις συγκαλλιέργειας του L. monocytogenes (πλαγκτονικά και κύτταρα βιοϋμενίων, 4.0 και 7.9 oC) με το μίγμα των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων βακτηρίων, σε μοντέλα ζωμού καπνιστής πέστροφας η ανάπτυξη του παθογόνου περιορίστηκε. Η συγκαλλιέργεια των πλαγκτονικών κυττάρων του παθογόνου με τον κάθε αλλοιωγόνο μικροοργανισμό ξεχωριστά, στους 4.0 oC φάνηκε να είναι συμβιωτική ενώ στους 7.9 oC, η ανάπτυξη των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών περιορίστηκε από την παρουσία του L. monocytogenes. Το αντίθετο φαινόμενο παρατηρήθηκε για τα κύτταρα βιοϋμενίων του L. monocytogenes, με εξαίρεση στους 7.9 oC, όπου η ανάπτυξη του L. monocytogenes περιορίστηκε από τα C. famata και C. zeylanoides.Τέλος, αξιολογήθηκε ο συνδυασμός δύο συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 και G6) και της υπερκατάψυξης στους –80 oC με σκοπό τη μείωση της έντασης της εφαρμοζόμενης υδροστατικής πίεσης (ΥΥΠ) που απαιτείται για την εξάλειψη του παθογόνου L. monocytogenes σε φιλέτα νωπής και καπνιστής πέστροφας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στα 200 MPa για 15 λεπτά, ενώ τα δείγματα εμβολιάστηκαν με τρία διαφορετικά στελέχη του L. monocytogenes (LO28, EGD-e και 10403S). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το στέλεχος 10403S του L. monocytogenes ήταν το πιο ανθεκτικό κατά την εφαρμογή της υψηλής υδροστατικής πίεσης (200 MPa, 15 λεπτά) και το G6 ήταν το πιο αποτελεσματικό εκχύλισμα καπνού. Στη συνέχεια, η υπερκατάψυξη των προϊόντων στους –80 oC πριν από την ΥΥΠ, φάνηκε να δρα συνεργιστικά οδηγώντας σε μείωση 2.90 και 3.23 log CFU/mL του πληθυσμού του παθογόνου, σε θρεπτικό ζωμό BHI χωρίς NaCl, παρουσία του G6 και L9, αντίστοιχα. Η εφαρμογή της ΥΥΠ, στα δείγματα καπνιστής πέστροφας με ή χωρίς συμπυκνώματα υγρού καπνού, πριν την κατάψυξη οδήγησε σε μικρή μείωση πληθυσμού (< 0.30 log CFU/g), όπως και στα δείγματα νωπής πέστροφας. Ωστόσο, παρατηρήθηκε σημαντική συνεργιστική δράση της ΥΥΠ, των συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 ή G6) και της κατάψυξης στους –80 oC, όταν εφαρμόστηκαν στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, με αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού του L. monocytogenes κατά 5.48 log CFU/g. Τέλος, παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα τραυματισμένων κυττάρων του L. monocytogenes (10403S), από την εφαρμογή των διαφορετικών εμποδίων. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, προέκυψε πως τα κύτταρα του L. monocytogenes που υπέστησαν ωσμωτικό σοκ παρουσίασαν αυξημένη αντοχή στη θερμική επεξεργασία, όπως και τα κύτταρα βιοϋμενίων, συγκριτικά με τα πλαγκτονικά. Ωστόσο, στο επακόλουθο εμπόδιο των υγρών καπνών μόνο τα κύτταρα βιοϋμενίων του παθογόνου παρουσίασαν ανθεκτικότητα (μετά από θερμική επεξεργασία), έναντι του αποτελεσματικότερου καπνού (L9). Παρουσία των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων βακτηρίων που απομονώθηκαν από τα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, τα κύτταρα του L. monocytogenes (πλαγκτονικά ή βιοϋμενίων) σε άλλες περιπτώσεις επικράτησαν και σε άλλες όχι ή αναπτύσσονταν συμβιωτικά, δείχνοντας πόσο σημαντική είναι η διερεύνηση της συμπεριφοράς της φυσικής παρουσίας του μικροβιώματος. Τελικά, παρατηρήθηκε σημαντική συνεργιστική δράση της ΥΥΠ, των συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 ή G6) και της κατάψυξης στους –80 oC, όταν εφαρμόστηκαν στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, με αποτέλεσμα τη μείωση του πιο ανθεκτικού στελέχους του L. monocytogenes.