Μοριακή επιδημιολογική διερεύνηση κλινικών στελεχών Campylobacter jejuni με τη μέθοδο τυποποίησης με βάση την αλληλουχία πολλαπλών γενετικών τόπων (MLST-Multilocus Sequence typing)

Abstract

Introduction: Campylobacter spp. is in Greece and worldwide one of the leadingcauses of human bacterial gastroenteritis.. The purpose of this study was to investigatethe molecular epidemiology of Campylobacter spp. in clinical strains isolated fromchildren with gastroenteritis in Greece, using the Multilocus Sequence Typing method(MLST).Materials and Methods: A total of 88 Campylobacter spp. strains of known serotypeand antimicrobial susceptibility were included, all of which were isolated andoriginally identified by means of conventional bacteriological standard procedures.The 88 strains were typed according to: 1) analysis of gene flaA 2) PFGE and 3)MLST. The MLST genotypes were compared with those gained by other typingmethods (HS-typing, PFGE and FlaA typing) and were also phylogeneticallyanalyzed, in order to uncover genetic relationships. The phylogenetic analysis wasbased a) on the results of converting the PFGE electrophoretic patterns into binarynumbers, and b) on the sequences of the MLST’s genes. Statistical analysis wasconducted to investigate the possible correlations between genotype methods, as wellas the possible association of the latter with antibiotic resistance.Results and conclusions: The application of molecular techniques revealed 33different flaA types, 42 PFGE types and 55 MLST types, demonstrating the advantageof the high resolution of the MLST method over other genotyping techniques. TheMLST method outdoes others, partly because it can give more genotypes, as well asbecause the sequencing data obtained, are directly comparable to those of otherstudies. Analytically, the high percentage of 55 different STs (13 new and 42 alreadyregistered), to which the 88 strains were classified, indicates that there is a significantST diversity (in terms of epidemiology) within this particular genus in Attica. Thisresult is in accordance with the fact, that all the hitherto reported cases were sporadic.Additionally, there was no predominance of a particular ST over others. Regardingthe 7 housekeeping genes included in the typing, no significant predominance of anallele was statistically observed in them. According to the research findings, 20 out of88 strains originally indentified as Campylobacter jejuni turned out to belong toMLST types of Campylobacter coli. Following the above, there was a phylogeneticanalysis, which showed that the C. coli themselves formed a separate group (cluster), which was statistically significant. To confirm these results, the classical phenotypicidentification by hydrolysis of hippuric acid was repeated, following strictly theinstructions οf recent studies and it was verified that these isolates were indeedCampylobacter coli. In conclusion, the MLST and PFGE methods can, not onlyprovide a reliable tool for typing Campylobacter strains for epidemiological studies,but they also enable us to obtain trustworthy information concerning theidentification. Phylogenetic analysis proved to be a very useful tool to confirm theidentification results of MLST, as well as to highlight the genetic mosaics of somestrains of C. coli and C. jejuni. In addition, the statistical analysis of the MLST resultsshowed a statistically significant correlation between some specific alleles and,resistance to certain antibiotics, a matter requiring further investigation.The above results have been used for the creation of a database, includingCampylobacter molecular typing markers for the first time in Greece.

Εισαγωγή: Τα καμπυλοβακτηρίδια (Campylobacter spp.) αποτελούν παγκοσμίωςμαζί με τις σαλμονέλλες τα συχνότερα αίτια βακτηριακής γαστρεντερίτιδας. Σκοπόςτης παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της μοριακής επιδημιολογίας τουCampylobacter στην Ελλάδα, σε κλινικά στελέχη που απομονώθηκαν από παιδιά μεγαστρεντερίτιδα, εφαρμόζοντας τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίαςπολυγενετικού τόπου (Multilocus Sequence Typing, MLST).Υλικά και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν 88 στελέχη Campylobacter spp. γνωστούοροτύπου και αντιμικροβιακής ευαισθησίας, των οποίων η απομόνωση και η αρχικήταυτοποίηση πραγματοποιήθηκαν με συμβατικές μεθόδους (καλλιέργεια σεεκλεκτικό υλικό Skirrow, μικροσκοπική εικόνα, υδρόλυση ιππουρικού οξέος, καιταυτοποίηση με το σύστημα εμπορίου API Campy). Όλα τα στελέχη τυποποιήθηκανμοριακά με: 1) ανάλυση του γονιδίου flaA («φλαγγελοτυπία»), 2) ηλεκτροφόρηση σεμεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) και 3) βάσει τις αλληλουχίες εφτάδιαχειριστικών γονιδίων (MLST). Επίσης πραγματοποιήθηκε ταξινόμηση σε«γονοτύπους» με φυλογενετική ανάλυση η οποία στηρίχτηκε α) στα αποτελέσματατης PFGE μετατρέποντας τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα σε δυαδικούς αριθμούς καιβ) στις αλληλουχίες των γονιδίων από την MLST. Πραγματοποιήθηκε στατιστικήανάλυση για να διερευνηθούν οι πιθανοί συσχετισμοί μεταξύ των γονοτυπικώνμεθόδων, καθώς επίσης και η πιθανή συσχέτιση αυτών με την αντοχή σε αντιβιοτικά.Αποτελέσματα-Συμπεράσματα: Η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών ανέδειξε 33«φλαγγελότυπους», 42 PFGE τύπους και 55 MLST τύπους, αποκαλύπτοντας τηνυψηλή διακριτική ικανότητα της MLST μεθόδου έναντι των άλλων γονοτυπικώντεχνικών. Η MLST μέθοδος υπερέχει αφενός γιατί μπορεί να δώσει περισσότερουςγονότυπους και αφετέρου γιατί λόγω της ανάλυσης αλληλουχίας τα δεδομένα πουπροκύπτουν είναι άμεσα συγκρίσιμα με αυτά άλλων μελετών. Ποιο αναλυτικά, τουψηλό ποσοστό των 55 διαφορετικών STs (13 νέοι και 42 ήδη καταχωρημένοι) στα88 στελέχη που εξετάστηκαν, φανερώνει από επιδημιολογική σκοπιά ότι υπάρχειέντονη ST ποικιλομορφία εντός του συγκεκριμένου γένους στην περιοχή της Αττικής,επιβεβαιώνοντας την γενετική ποικιλομορφία του Campylobacter spp. και τηνσποραδικότητα των κρουσμάτων. Επίσης δεν παρατηρήθηκε επικράτηση κάποιουσυγκεκριμένου ST έναντι των άλλων. Όσον αφορά τα 7 διαχειριστικά γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν σ’ αυτήν την τυποποίηση δεν παρατηρήθηκε στατιστικάσημαντική επικράτηση κάποιου αλληλόμορφου για το κάθε γονίδιο. Από τααποτελέσματα της MLST παρουσιάστηκαν 20 στελέχη που άνηκαν σε MLST τύπουςCampylobacter coli. Ακολούθησε φυλογενετική ανάλυση, η οποία έδειξε πως αυτάομαδοποιούνταν μόνα τους στατιστικά σημαντικά, σε διαφορετική φυλογενετικήομάδα (cluster) από τα υπόλοιπα στελέχη. Προς επιβεβαίωση των ανωτέρωναποτελεσμάτων, επαναλήφθηκε η κλασσική φαινοτυπική ταυτοποίηση με τηνυδρόλυση του ιππουρικού οξέος, τηρώντας πιστά τις οδηγίες πρόσφατων μελετώνπου έθιγαν το θέμα και πιστοποιήθηκε, ότι πράγματι αυτά τα στελέχη ήτανCampylobacter coli. Συμπερασματικά, οι μέθοδοι MLST και PFGE μας παρέχουνσημαντικές δυνατότητες αξιόπιστης τυποποίησης στελεχών Campylobacter γιαεπιδημιολογικές μελέτες, επιπλέον δε η μέθοδος MLST μπορεί να δώσει και πολύαξιόπιστες ταυτοποιητικές πληροφορίες. Η φυλογενετική ανάλυση είναι ένα πολύχρήσιμο εργαλείο για την επιβεβαίωση των ταυτοποητικών δυνατοτήτων της MLSTκαι την αποκάλυψη του γενετικού μωσαϊκού κάποιων στελεχών C. coli και C. jejuni.Επιπλέον, από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της MLST μεθόδουπροέκυψαν στατιστικώς σημαντική συσχέτιση κάποιων συγκεκριμένωναλληλομόρφων γονιδίων με αντοχή σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά, η οποία θέλειπεραιτέρω διερεύνηση. Τέλος δημιουργήθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα μια βάσηδεδομένων για Campylobacter spp. η οποία περιέχει χαρακτηριστικά υψηλούεπιδημιολογικού ενδιαφέροντος.