Ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων και μορίων του εξωκυττάριου χώρου στους όγκους μεσεγχυματικής προέλευσης

Abstract

This thesis focuses on studying the mechanisms which regulate the biological functions of tumors with a mesenchymal origin. Sarcomas are types of tumor which develop from differentiated cells of the connective tissues of the human body, and therefore can rise from tissues, like bone, cartilage, blood or vessels. Sarcomas are classified into two categories depending on the tissue and the cell type of their origin. Thus, there are bone sarcomas, like osteosarcoma, chondrosarcoma, and sarcomas of soft tissues, like fibrosarcoma.In this study, we aimed to identify the signaling pathways which participate in sarcoma progression in three different human cell lines e.g., osteosarcoma (MG63), chondrosarcoma (HTB94), and fibrosarcoma (HT1080) respectively. Tumor cells produce a modified extracellular matrix compared to healthy tissues, and interaction with the deregulated ECM modulates these cells's biological functions. ECM consists of a complicated system of proteoglycans, fibrous proteins and hyaluronic acid, and its role is supportive, but also protective of each tissue's cells. Furthermore, ECM creates and transfers many different signals between cells/tissues, affecting their behavior and functions. ECM also acts as a reserve for growth factors like transforming growth factor-beta (TFG-β) or insulin-like growth factor I (IGF-I) and other biologically significant macromolecules able to change cellular behavior. Proteoglycans (PGs) are molecules that consist of glycosaminoglycan chains (GAGs) covalently bound into a protein core. These proteins undergo various post-translational changes, and they can affect cellular function and cancer progression through a plethora of signaling pathways. Many studies have shown that PGs are localized to the cell surface but are also secreted into the ECM, like small leucine rich proteoglycans (SLRPs). This direct interaction with the extracellular environment gives them the ability to transmit cues from the ECM to the cells and finally act as signaling molecules that control cellular functions, like proliferation, migration, differentiation, and further ECM composition. It is also shown that SLRPs interact with tyrosine kinase receptors, which affects their downstream signaling and cellular behavior. More specifically, some SLRPs, like biglycan and lumican, participate in bone formation and homeostasis regulation and have specific roles in the different phases of these processes. Furthermore, transmembrane proteoglycans, like syndecan 2, have essential roles in regulating cellular functions of fibrosarcoma and other types of malignancy. Therefore, PGs act like regulators of signaling molecules and pathways and could be used as target molecules either for therapeutic purposes or as diagnostic molecules for pathological conditions.IGF-I is a well-established anabolic hormone with proven oncogenic properties. Most of its functions are performed through two main signaling pathways, PI3K / Akt (phosphoinositide 3-kinase/ serine/threonine kinase Akt) and that of MAPK (mitogen-activated protein kinase). Biglycan, an SLRP, has an active role in bone formation, development, and homeostasis. This study shows how biglycan regulates the growth of MG63 human osteosarcoma cells positively. IGF-I increases the expression of this SLRP, while biglycan-deficient cells have attenuated both basal and IGF-I induced proliferation. These effects were mediated through the IGF-IR receptor whose activation was strongly attenuated in biglycan-deficient MG63 cells. Previously, it has been shown that biglycan regulates Wnt/b-catenin signaling pathway, and our results indicate that biglycan increases b-catenin expression in all cellular fractions due to its co-localization with Wnt co-receptor LRP6. This interaction leads to reduced degradation of b-catenin in the cytoplasm and enhances its translocation to the nucleus, where it activates the transcription of target genes, responsible for controlling the cell cycle. Besides, we have shown an interaction between b-catenin and the activated IGF-IR, which is increased upon treating MG63 cells with exogenous biglycan. In parallel, the down-regulation of biglycan significantly inhibited both basal and IGF-I induced ERK1/2 activation, a molecule that mediates IGF-I signaling, as we have previously reported. In summary, biglycan, through a LRP6/IGF-IR/b-catenin signaling axis, enhances osteosarcoma cell growth. In the next part of the study, it was shown that lumican is the main expressed and secreted SLRP in HTB94 human chondrosarcoma cells, while decorin and biglycan are poorly expressed. Lumican positively affects the proliferation of HTB94 cells as lumican deficiency inhibited the basal and IGF-I induced HTB94 cell growth significantly. The oncogenic action of IGF-I is mediated by its receptor, IGF-IR, whose phosphorylation levels are strongly attenuated in lumican-deficient cells. Furthermore, lumican levels affect ERK1/2 activation, which seems to be crucial to IGF-I dependent HTB94 cell growth. Moreover, lumican-deficient cells exhibit increased mRNA levels of p53 suggesting that lumican facilitates chondrosarcoma cell growth through an IGF-IR/ ERK1/2/p53 signaling cascade. In summary, we show that endogenous lumican is a novel regulator of HTB94 cell growth. Finally, we studied the action of IGF-I on HT1080 fibrosarcoma cells, and our results show that it enhances their migration ability. SDC2, a transmembrane PG, appears to act as a co-receptor for IGF-I since it colocalizes with IGF-IR. Suppression of this PG expression reduces IGF-I dependent cell migration. In order to investigate how SDC2 affects this signaling pathway and consequently, IGF-I induced cell migration, we studied its role in ERK1/2 activation. Our results indicate that SDC2 is essential for ERK1/2 phosphorylation and that it is necessary for IGF-I dependent HT1080 migration. Additionally, we looked at ezrin, a protein that connects membrane receptors to the cytoskeleton and is found to be colocalized with SDC2. The formation of an immunoprecipitative complex revealed an association between SDC2 and ezrin, which was enhanced through IGF-I action in HT1080 cells. Ezrin activation is also affected by IGF-I action. To conclude, SDC2 mediates directly IGF-I-induced ERK1/2 activation; it recruits ezrin, contributes to actin polymerization, and ezrin/actin specific localization to cell membranes, ultimately facilitating the progression of IGF-I dependent fibrosarcoma cell migration. The above-described mechanisms reveal PGs's involvement in mesenchymal origin tumor progression and their interaction with the IGF-I signaling pathway to regulate basal functions of these cancer cells.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των μηχανισμών λειτουργίας των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης. Τα σαρκώματα είναι ένας τύπος καρκίνου που προέρχεται από μετασχηματισμένα κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης και μπορούν να αναπτυχθούν σε οποιονδήποτε τύπο συνδετικού ιστού, όπως στα οστά, τους χόνδρους, τα αγγεία ή το αίμα. Αυτοί οι πρωτογενείς όγκοι του συνδετικού ιστού χωρίζονται σε δύο κατηγορίες βάσει του ιστού και του τύπου των κυττάρων από τα οποία προέρχεται ο όγκος: τα σαρκώματα των οστών, όπως το οστεοσάρκωμα και το χονδροσάρκωμα, και τα σαρκώματα των μαλακών ιστών, όπως το ινοσάρκωμα. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε στον εντοπισμό των οδών σηματοδότησης που συμμετέχουν στην εξέλιξη του σαρκώματος σε τρεις διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, οστεοσάρκωμα (MG63), χονδροσάρκωμα (HTB94) και ινοσάρκωμα (HT1080) αντίστοιχα. Τα κύτταρα των όγκων αυτών παράγουν διαφορετική εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) συγκριτικά με τους φυσιολογικούς ιστούς και αλληλεπιδρούν με αυτή προκειμένου να ρυθμίσουν τις κυτταρικές τους λειτουργίες. Η ECM αποτελεί ένα πολύπλοκο δίκτυο πρωτεογλυκανών, ινωδών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος και έχει στηρικτικό και προστατευτικό ρόλο για τα κύτταρα εντός των ιστών. Επίσης, η ECM δημιουργεί και μεταφέρει πολλαπλά σύνθετα ερεθίσματα στα κύτταρα επηρεάζοντας τη συμπεριφορά τους και τις λειτουργίες τους, αφού αποτελεί μια δεξαμενή αυξητικών παραγόντων όπως ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (TGF-β) ή ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας Ι (IGF-I) και άλλων σημαντικών βιολογικά μακρομορίων που είναι αποδεδειγμένο ότι επηρεάζουν την κυτταρική συμπεριφορά. Οι πρωτεογλυκάνες είναι μόρια που αποτελούνται από γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAGs), ομοιοπολικά συνδεδεμένες σε ένα πρωτεϊνικό κορμό. Οι πρωτεΐνες αυτές υφίστανται πολλές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις και έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν τις κυτταρικές λειτουργίες και την πρόοδο ενός όγκου μέσω διαφορετικών μονοπατιών. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεογλυκάνες εντοπίζονται στην κυτταρική επιφάνεια, αλλά εκκρίνονται επίσης στην ECM, όπως μικρές πρωτεογλυκάνες πλούσιες σε λευκίνη (SLRPs). Αυτή η άμεση αλληλεπίδραση με το εξωκυττάριο περιβάλλον τους δίνει την ικανότητα να μεταβιβάζουν πληροφορίες από την ECM στα κύτταρα και τελικά ενεργούν ως μόρια σηματοδότησης που ελέγχουν τις κυτταρικές λειτουργίες, όπως πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, διαφοροποίηση και περαιτέρω σύνθεση ECM. Αυτή η άμεση επαφή τους με το εξωκυττάριο περιβάλλον τους δίνει την ικανότητα να μεταβιβάζουν τις εξωκυττάριες αλλαγές εντός του κυττάρου και τελικά να λειτουργούν ως σηματοδοτικά μόρια που ελέγχουν τις κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η εναπόθεση οργανικής εξωκυττάριας ουσίας, η κυτταρική μετανάστευση και ο κυτταρικός μετασχηματισμός. Έχει δειχθεί πως οι SLRPs συχνά αλληλεπιδρούν με υποδοχείς κινάσης τυροσίνης και αυτός είναι ένας από τους βασικούς μηχανισμούς δράσης τους στα κύτταρα ώστε να επηρεάσουν την κατάντη σηματοδότηση των υποδοχέων και συνεπώς τα ενδοκυττάρια μονοπάτια που ρυθμίζουν την κυτταρική συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, κάποιες SLRPs, όπως η διγλυκάνη και η λουμικάνη, εμπλέκονται λειτουργικά στη φυσιολογική ανάπτυξη των οστών και την ομοιόσταση και έχουν ειδικούς ρόλους σε όλες τις φάσεις σχηματισμού των οστών. Επίσης, διαμεμβρανικές πρωτεογλυκάνες, όπως η συνδεκάνη 2, έχουν σημαντικούς ρόλους στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών στο ινοσάρκωμα αλλά και άλλους καρκινικούς τύπους. Επομένως, ως ρυθμιστές των σηματοδοτικών μορίων και γενικότερα μονοπατιών, οι πρωτεογλυκάνες μπορούν να λειτουργήσουν ως μόρια-στόχοι, καθώς η τοποθεσία και η λειτουργία τους παρέχουν προσβασιμότητα για αποτελεσματική θεραπευτική παρέμβαση ή διάγνωση παθολογικών καταστάσεων. Ο IGF-I είναι μια γνωστή αναβολική ορμόνη, με ισχυρά αποδεδειγμένες ογκογόνες ιδιότητες, και για την πλειοψηφία των λειτουργιών που επιτελεί δρα μέσω δύο κύριων σηματοδοτικών μονοπατιών, αυτό του PI3K/Akt (phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine kinase Akt) και του MAPK (mitogen-activated protein kinase). Η διγλυκάνη, μια SLRP, έχει ενεργό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της ομοιόστασης των οστών. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η διγλυκάνη ρυθμίζει θετικά την ανάπτυξη των κυττάρων του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος. Ο αυξητικός παράγοντας IGF-I φαίνεται να αυξάνει την έκφραση της διγλυκάνης, ενώ τα ελλιπή κύτταρα σε αυτή την πρωτεογλυκάνη έχουν μειωμένους βασικούς και εξαρτώμενους από IGF-I πολλαπλασιαστικούς ρυθμούς. Επιπλέον, τα κύτταρα αυτά δείχνουν μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης και συνεπώς ενεργοποίησης του υποδοχέα του IGF-I, IGF-IR. Προηγούμενα πειράματα έχουν δείξει ότι η διγλυκάνη ρυθμίζει το μονοπάτι Wnt/β-κατενίνης, ενώ τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διγλυκάνη αυξάνει την έκφραση της β-κατενίνης σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα, λόγω του συνεντοπισμού της με τον συνυποδοχέα του Wnt μονοπατιού, LRP6. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί σε μειωμένους ρυθμούς αποδόμησης της β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα τη μεταφορά της στον πυρήνα και την ενεργοποίηση γονιδίων-στόχων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Εκτός αυτού, έχουμε δείξει μια αλληλεπίδραση μεταξύ της β-κατενίνης και του ενεργοποιημένου IGF-IR, η οποία αυξάνεται κατά τη χορήγηση της εξωγενούς διγλυκάνης στα MG63 κύτταρα. Παράλληλα, μείωση στην έκφραση της διγλυκάνης ανέστειλε σημαντικά τόσο τη βασική όσο και από τον IGF-I επαγόμενη ενεργοποίηση ERK1/2, μορίου που μεσολαβεί τη σηματοδότηση του IGF-I, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Συνολικά, η διγλυκάνη, μέσω ενός άξονα σηματοδότησης των μορίων LRP6/IGF-IR/β-κατενίνης, ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων του οστεοσαρκώματος MG63. Στο επόμενο μέρος της μελέτης, αποδείχθηκε ότι η λουμικάνη είναι η κύρια εκφραζόμενη και εκκρινόμενη SLRP σε HTB94 κύτταρα του ανθρώπινου χονδροσαρκώματος, ενώ η ντεκορίνη και η διγλυκάνη εκφράζονται ελάχιστα. Η λουμικάνη επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό θετικά, αφού HTB94 κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη εμφανίζουν μειωμένους βασικούς και εξαρτώμενους από IGF-I πολλαπλασιαστικούς ρυθμούς. Η ογκογόνος δράση του IGF-I μεσολαβείται από τον υποδοχέα του IGF-IR, ο οποίος εμφανίζει μειωμένη ενεργοποίηση σε κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη. Επιπλέον, τα επίπεδα της λουμικάνης επηρεάζουν την ενεργοποίηση ERK1/2, που φαίνεται να είναι απαραίτητος μεσολαβητής της εξαρτώμενης από IGF-I ανάπτυξης των κυττάρων HTB94. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνονται και εξετάζοντας την έκφραση γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, αφού κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη έχουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53.Τέλος, μελετήσαμε τη δράση του IGF-I στα κύτταρα του ινοσαρκώματος HT1080 και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενισχύει τη μεταναστευτική τους ικανότητα. Η διαμεμβρανική πρωτεογλυκάνη συνδεκάνη 2 (SDC2) φαίνεται να δρα σαν συνυποδοχέας του IGF-I αφού συνεντοπίζεται με τον IGF-IR. Καταστολή της έκφρασης της συγκεκριμένης πρωτεογλυκάνης μείωσε την εξαρτώμενη από IGF-I μετανάστευση των κυττάρων. Για να μελετήσουμε τον τρόπο με τον οποίο η SDC2 επηρεάζει τη σηματοδότηση και κατά συνέπεια την κυτταρική μετανάστευση μέσω του IGF-I, εξετάσαμε την επίδρασή της στην ενεργοποίηση του ERK1/2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η SDC2 είναι απαραίτητη για τη φωσφορυλίωση του και ότι ο ERK1/2 είναι αναγκαίος για την επαγόμενη από IGF-I μετανάστευση των HT1080. Επίσης, μελετήσαμε την ezrin, μια πρωτεΐνη που συνδέει μεμβρανικούς υποδοχείς με τον κυτταροσκελετό και έχει βρεθεί να συνεντοπίζεται με την SDC2. Ο συνεντοπισμός των δύο αυτών μορίων επιβεβαιώθηκε και στα κύτταρα ινοσαρκώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της ezrin επηρεάζεται από τον IGF-I. Επομένως, η SDC2 διευκολύνει την επαγόμενη από IGF-I κυτταρική μετανάστευση στο ινοσάρκωμα. Με τους παραπάνω μηχανισμούς αναδεικνύεται σε μεγάλο βαθμό η συμμετοχή των πρωτεογλυκανών στην πρόοδο των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης και η αλληλεπίδραση τους με το σηματοδοτικό μονοπάτι του IGF-I, ώστε τελικά να ρυθμιστούν βασικές λειτουργίες αυτών των καρκινικών κυττάρων.