Η έκφραση της Ε3, Ε4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στον καρκίνο

Abstract

Homeodynamics is a fundamental feature of single and multi-cellular organisms that is maintained by convenient cellular counteractions to a plethora of deleterious intrinsic and extrinsic signals (Lloyd, Aon et al. 2001). Aberrations in the modulating pathways that govern these responses result in excess of damage, functional defects and disease such as cancer (Gorgoulis and Halazonetis 2010). In cancer cells, one of the most frequently affected cellular functions is the proper execution of the cell cycle that under conditions can impose genomic instability (Negrini, Gorgoulis et al. 2010). In the last years, the latter has been established as one of the hallmarks of cancer cells (Hanahan and Weinberg 2011). One biological process which has been demonstrated to be directly compatible with replication stress is the oncogene induced cellular proliferation (Halazonetis, Gorgoulis et al. 2008). Under normal circumstances, as soon as any DNA lesion has been detected, various proteins which regulate cell cycle are getting activated in order to trigger the stop of cell cycle progression. These proteins are in the service of a sophisticated response mechanism against genomic alterations which is called DNA Damage Response (DDR)(Jackson and Bartek 2009). In case DNA lesions cannot be repaired, the cell is driven to apoptosis or senescence. Both procedures are able to potentially function as tumor barriers (Jackson and Bartek 2009). Post-translational modifications constitute and important strategy of the cell in order to respond dynamically to intrinsic or environmental changes caused by growth factors, stressors or differentiation signals (Weissman 2001). Protein modifications can be induced through diverse processes such as methylation, acetylation, hydroxylation, phosphorylation, ubiquitination or via the conjugation of ubiquitin-like(Ubl) proteins (Weissman 2001, Sun and Chen 2004).Ubiquitination is a type of post-translational modification considered as an essential cellular mechanism which plays a significant role in various operations such as cellular proliferation and growth, DNA repair, transcriptional regulation, internal signal transition, autophagy, cell cycle and apoptosis (Hershko and Ciechanover 1998, Chondrogianni and Gonos 2012, Streich and Lima 2014). Ubiquitin system was initially discovered as a mechanism which targets defective proteins for degradation through the proteasome (Ravid and Hochstrasser 2008). Since ubiquitination is a multistep process, it is implemented by different enzymes named Ε1, Ε2, Ε3 ubiquitin ligases which aim to drive marked proteins with ubiquitin moieties to proteasome-dependent degradation (Shenoy 2007, Hoeller and Dikic 2009, Berndsen and Wolberger 2014).A number ofΕ3 ligases have been linked with cancer growth mainly due to their ability to promote the degradation of oncogenes or tumor suppressive factors (Hoeller, Hecker et al. 2006, Nakayama and Nakayama 2006, Bernassola, Karin et al. 2008). E3 ligases are discriminated in proportion to the structure of their catalytic domain in three main categories which are HECT, RING και U-BOX (Ardley and Robinson 2005). Well-documented E3 ligases with oncogenic role are, RING-type Hdm2, an important negative regulator of the tumor suppressor p53 as well as the SCF ligases (they include many subunits), which regulate cell cycle progression. Depending on their substrate selectivity every E3 ligase is able to act either promoting oncogenesis or halting it while enzyme’s behavior may be diversified depending also on the type of the tissue where it is expressed (Bond, Hu et al. 2005, Vousden and Prives 2005). The E4B (UBE4B) ubiquitination factor in human is the homolog protein of UFD2 which has been found in Saccharomyces cerevisiae (Hatakeyama, Yada et al. 2001, Caren, Holmstrand et al. 2006). UBE4Bgeneislocatedinthesmallarmofchromosome 1 and is considered as a possible tumor suppressor in neuroblastoma, a type of cancer which affects the sympathetic nervous system in childhood (Caren, Holmstrand et al. 2006). The human UBE4B/UFD2a is a newly identified E3 ubiquitin ligase which includes a U-BOX type catalytic domain (Hatakeyama, Yada et al. 2001). Its homolog protein in yeast, UFD2, is involved in a not so recently described degradation pathway via proteasome namely UFD (ubiquitin fusion degradation) pathway (Johnson, Ma et al. 1995). Later a new family of ubiquitin ligases was discovered, which is called E4 and where UFD2 has been enrolled (Koegl, Hoppe et al. 1999).Unless the well documented E3 ligases which mono-ubiquitinate or multi-mono-ubiquitinate their substrates, E4 ligases in collaboration with the rest ligases catalyze the extension of the existed oligoubiquitin chain on the substrate (Park, Yoon et al. 2009, McDowell and Philpott 2013). According to recent data, UBE4B has been found to be over expressed in the majority of patients with both breast and liver cancer (Zhang, Lv et al. 2014, Zhang, Pan et al. 2016). There are also indications that UBE4B functions as an oncogenic factor and is linked with one of the most common characteristics of cancer cells which is their resistance to apoptosis. It has been shown that in a variety of human cell lines, UBE4B interacts with the negative regulator of the pro-apoptotic factor p53, HDM2 (Ε3 ligase) and triggers the poly-ubiquitination of p53 in order to transmit to the proteasome for degradation (Wu, Pomeroy et al. 2011, Zhang, Lv et al. 2014). The oncogenic role of UBE4B is supported by the fact that upon induction of DNA damage via γ-radiation in cancer cell lines, UBE4B polyubiquitinates the phosphorylated p53 at Serine 15 and 392. The latter protein is well-known as the genome “guardian” of the cell and its phosphorylated form at the aforementioned sites usually leads to the cancelation of cell cycle progression in order the damage to get repaired (Du, Wu et al. 2016).Finally, the homolog protein of hUBE4B in Caenorhabditis elegans is correlated with two essential biological processes for cancer’s development and progress namely apoptosis and homologous recombination (HR). The latter constitutes one of the basic DNA repair mechanisms with regard to Double Strand Breaks (DSBs). It is noteworthy that UBE4B acts as a mediator molecule contributing to the interconnection between apoptosis and HR following DNA damage occurrence in order to prevent them from being active simultaneously (Ackermann, Schell et al. 2016). The herein PhD thesis is focused on the investigation of UBE4B’s expression and role in the progression and development of cancer, in coordination with apoptosis, DDR and DNA repair. In the current study there were used both in vitro (cancerous and normal cell lines) and in vivo (human tissue biopsies) biological systems. Among the latter there were employed colon cancer tissues that represented all the stages of carcinogenesis, in order to clarify how much early in carcinogenesis is UBE4B expressed and if it finally plays an oncogenic or tumor suppressor role. The study was performed through the application of biochemical, molecular methods along with methods of optical microscopy. More particularly, in the frame of the current PhD thesis there were examined the following scientific questions: 1) Which is the expression of Ε3/Ε4 UBE4B ligase in vivo (human tissue biopsies) in colon and lung cancer? 2) Is there any correlation between UBE4B and the protein expression levels of its main substrate wild type p53 in human colon and lung cancer tissues? 3) What is the cause of UBE4B’s increase regarding its protein levels which was detected in the majority of the studied tissues, in the malignant areas compared to their neighboring normal one? 4) Is UBE4B expressed in preliminary stages during carcinogenesis in human colon as well as head and neck? 5) What does it happen with the expression of UBE4B ligase in cancer cell lines upon induction of DNA Damage? Is it somehow implicated in DNA repair and apoptosis? Τhe answers to the above queries are presented in Chapter 3. Taking all into consideration, this dissertation offers justified evidence that render UBE4B a new and potentially candidate oncogenic factor which is overexpressed even from the early benign stages in the progression of colon and lung cancer. This observation seems to happen due to UBE4B’s elevated mRNA levels or to post-translational modifications in protein level. In accordance to other scientific reports which are focused on the investigation of UBE4B’s role in repair mechanisms, this specific PhD thesis demonstrates UBE4B as an essential player in view of DDR network and molecular carcinogenesis as well. All in all, further elucidation as far as the role of E3/E4 UBE4B ubiquitin ligase in carcinogenesis is necessary while it constitutes a novel and promising research field which could enhance the participation of this protein in future therapeutic intervention with a possibly important clinical effect.

Η ομοιόσταση συνιστά θεμελιώδη ιδιότητα των οργανισμών και εξασφαλίζεται μέσω πληθώρας κυτταρικών αποκρίσεων έναντι ενδογενών και εξωγενών παραγόντων (Lloyd, Aon et al. 2001). Η διαταραχή των μηχανισμών που ελέγχουν τις διαδικασίες αυτές οδηγεί στη συσσώρευση βλαβών και γενικά στην απορρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας με επακόλουθο την εμφάνιση νόσων, όπως ο καρκίνος (Gorgoulis and Halazonetis 2010, Hanahan and Weinberg 2011). Στους όγκους παρατηρείται συχνά διατάραξη της ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, που υπό προϋποθέσεις, μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση γενωμικής αστάθειας (Negrini, Gorgoulis et al. 2010). Η τελευταία έχει καθιερωθεί τα τελευταία χρόνια ως χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων (Hanahan and Weinberg 2011).Μια βιολογική διεργασία που έχει δειχθεί ότι είναι άμεσα συμβατή με το αντιγραφικό στρες και επομένως οδηγεί σε γενωμική αστάθεια, είναι ο προκαλούμενος από ογκογονίδιο κυτταρικός πολλαπλασιασμός (Halazonetis, Gorgoulis et al. 2008). Υπό φυσιολογικές συνθήκες μόλις εντοπιστεί κάποια βλάβη στο DNA, ενεργοποιούνται πρωτεΐνες που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο με σκοπό τη διακοπή του τελευταίου στα πλαίσια ενός προηγμένου κυτταρικού δικτύου που ονομάζεται μηχανισμός απόκρισης γενωμικών βλαβών (DDR) (Jackson and Bartek 2009). Εφόσον δεν καταφέρουν να επιδιορθωθούν οι εντοπισμένες βλάβες τότε το κύτταρο οδηγείται είτε σε απόπτωση είτε σε γήρανση, διεργασίες που μπορούν δυνητικά να λειτουργήσουν ως εμπόδιο έναντι της καρκινογένεσης (Jackson and Bartek 2009). Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις αποτελούν γενικά μια σημαντική στρατηγική που δίνει τη δυνατότητα στα κύτταρα να ανταποκρίνονται δυναμικά σε ενδογενείς ή περιβαλλοντικές αλλαγές, προκαλούμενες από στρεσογόνους, αυξητικούς παράγοντες ή από σήματα διαφοροποίησης (Weissman 2001). Τροποποιήσεις μιας πρωτεΐνης μπορεί να προκληθούν μέσω διαφόρων διεργασιών όπως είναι η μεθυλίωση, η ακετυλίωση, η υδροξυλίωση, η φωσφορυλίωση, η ουβικουïτινίωση ή η προσθήκη πρωτεϊνικών ομάδων που είναι συναφείς με εκείνες της ουβικουϊτίνης (Weissman 2001, Sun and Chen 2004). Η ουβικουïτινίωση είναι ένα είδος μετα-μεταφραστικής τροποποίησης αποτελώντας έναν στοιχειώδη κυτταρικό μηχανισμό που παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες λειτουργίες όπως η κυτταρική αύξηση και ανάπτυξη, η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού, η μεταγραφική ρύθμιση, η μεταγωγή σημάτων εντός του κυττάρου, η αυτοφαγία, ο κυτταρικός κύκλος και ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (Hershko and Ciechanover 1998, Chondrogianni and Gonos 2012, Streich and Lima 2014). Το σύστημα ουβικουϊτινίωσης ανακαλύφθηκε αρχικά ως ένας μηχανισμός που στοχοποιεί πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος για αποικοδόμηση μέσω του πρωτεασώματος (Ravid and Hochstrasser 2008). Όντας μια πολυσταδιακή διαδικασία, η ουβικουϊτινίωση επιτελείται από διαφορετικά ένζυμα που ονομάζονται Ε1,E2, E3 λιγάσες ουβικουϊτίνης με τελικό σκοπό την αποικοδόμηση της σημασμένης πρωτεΐνης από το πρωτεάσωμα (Shenoy 2007, Hoeller and Dikic 2009, Berndsen and Wolberger 2014). Πολλές E3 λιγάσες έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου, κυρίως εξαιτίας της ικανότητά τους να προάγουν την αποικοδόμηση ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικών παραγόντων (Hoeller, Hecker et al. 2006, Nakayama and Nakayama 2006, Bernassola, Karin et al. 2008). Οι E3 λιγάσες διακρίνονται ανάλογα με τη δομή του ενεργού τους κέντρου σε HECT, RING και U-BOX (Ardley and Robinson 2005). Aρκετά καλά μελετημένες E3 λιγάσες με ογκογόνο ρόλο, είναι η τύπου RING Ηdm2, ένας σημαντικός αρνητικός ρυθμιστής του ογκοκατασταλτικού παράγοντα p53, καθώς και οι SCF λιγάσες (διαθέτουν πολλές υπομονάδες), που ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Εξαρτώμενη από την υποστρωματική της επιλεκτικότητα μια E3 λιγάση μπορεί να δράσει είτε προωθώντας την ογκογόνο ανάπτυξη είτε καταστέλλοντάς τη ενώ η συμπεριφορά της μπορεί να ποικίλλει και ανάλογα με το είδος του ιστού στον οποίο εκφράζεται (Bond, Hu et al. 2005, Vousden and Prives 2005). Ο παράγοντας ουβικουϊτινίωσης Ε4Β (UBE4B) στον άνθρωπο αποτελεί την ομόλογη πρωτεΐνη της UFD2 η οποία έχει βρεθεί στο σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae (Hatakeyama, Yada et al. 2001, Caren, Holmstrand et al. 2006). Το γονίδιο της UBE4B βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 1 και θεωρείται πιθανά ογκοκατασταλτικό στην περίπτωση του νευροβλαστώματος, ενός τύπου καρκίνου που επιδρά στο συμπαθητικό νευρικό σύστημα κατά την παιδική ηλικία (Caren, Holmstrand et al. 2006).Η ανθρώπινη UBE4B/UFD2a είναι μια σχετικά νεοεμφανιζόμενη E3 λιγάση ουβικουϊτίνης που φέρει ένα καταλυτικό κέντρο τύπου U-BOX (Hatakeyama, Yada et al. 2001). Η ομόλογη πρωτεΐνη που φέρει η ζύμη, UFD2, εμπλέκεται σε ένα όχι και τόσο πρόσφατα περιγραφόμενο μονοπάτι αποικοδόμησης μέσω του πρωτεασώματος, που ονομάζεται UFD (ubiquitin fusion degradation) μονοπάτι (Johnson, Ma et al. 1995). Αργότερα, ανακαλύφθηκε μια καινούργια οικογένεια λιγασών που ονομάζονται Ε4 λιγάσες ουβικουϊτίνης όπου εντάχθηκε και η UFD2 (Koegl, Hoppe et al. 1999). Σε αντίθεση με τις E3 λιγάσες που μονοουβικουϊτινιώνουν ή πολυμονοουβικουϊτινιώνουν τα υποστρώματά τους, οι Ε4 λιγάσες συνεργαζόμενες με τις υπόλοιπες λιγάσες καταλύουν την επέκταση της ήδη υπάρχουσας ολιγοουβικουϊτινικής αλυσίδας (Park, Yoon et al. 2009, McDowell and Philpott 2013). Mε βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία, το UBE4B έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται στην πλειοψηφία ασθενών με καρκίνο μαστού και ήπατος (Zhang, Lv et al. 2014, Zhang, Pan et al. 2016). Επίσης υπάρχουν ενδείξεις ότι το UBE4B λειτουργεί ως ογκογόνος παράγοντας και σχετίζεται με ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων που είναι η αντίσταση στην απόπτωση. Έχει βρεθεί ότι σε μια ποικιλία ανθρώπινων κυτταρικών σειρών, η πρωτεΐνη UBE4B αλληλεπιδρά με τον αρνητικό ρυθμιστή HDM2 (Ε3 λιγάση), του αποπτωτικού παράγοντα p53, και επάγει την πολύ-ουβικουϊτινίωση του τελευταίου στοχεύοντάς το προς αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα (Wu, Pomeroy et al. 2011, Zhang, Lv et al. 2014). Ο ογκογόνος ρόλος της UBE4B ενισχύεται αφού μετά από πρόκληση γενωμικών βλαβών με γ-ακτινοβολία σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, η UBE4B πολυ-ουβικουïτινιώνει τη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη p53 στις θέσεις σερίνη 15 και 392. Η τελευταία είναι ιδιαίτερα σημαντική πρωτεΐνη καθώς η ενεργοποίησή της μέσω της φωσφορυλίωσής της στις παραπάνω θέσεις οδηγεί στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου προκειμένου να γίνει η επιδιόρθωση των βλαβών (Du, Wu et al. 2016). Τέλος, η ομόλογη της UBE4B, Ε4 λιγάση στο νηματώδη σκώληκα σχετίζεται με δύο σημαντικές βιολογικές διαδικασίες για την ανάπτυξη και προαγωγή του καρκίνου όπως είναι η απόπτωση και ο ομόλογος ανασυνδυασμός που αποτελεί έναν από τους βασικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης δικλωνικών θραύσεων στο DNA. Λειτουργεί λοιπόν, ως ένα μόριο διαμεσολαβητής που συμβάλλει στην ενδοεπικοινωνία μεταξύ των δύο διαδικασιών ύστερα από τη δημιουργία βλαβών στο DNA, ώστε αυτές να μην συμβαίνουν ταυτόχρονα (Ackermann, Schell et al. 2016). Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη διερεύνηση της έκφρασης και του ρόλου της Ε3,4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στην προαγωγή και ανάπτυξη του καρκίνου, σε συνάρτηση με τους μηχανισμούς απόπτωσης, απόκρισης και επιδιόρθωσης βλαβών του DNA. H μελέτη πραγματοποιήθηκε τόσο σε in vitro συστήματα (καρκινικές και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές) όσο και in vivo συστήματα (αρχειακό βιοπτικό υλικό). Μεταξύ των τελευταίων χρησιμοποιήθηκαν βιοψίες παχέος εντέρου που αντιπροσωπεύουν όλα τα στάδια εξέλιξης της καρκινογένεσης, ώστε να διευκρινισθεί πόσο πρώιμα εκφράζεται η UBE4B και αν τελικά έχει ογκογόνο ή ογκοκατασταλτικό ρόλο. Η μελέτη διεξήχθη με τη εφαρμογή βιοχημικών, μοριακών μεθόδων, καθώς και μεθόδων οπτικής μικροσκοπίας. Πιο συγκεκριμένα στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκαν τα παρακάτω επιστημονικά ερωτήματα: 1) Ποιά είναι η έκφραση της Ε3, Ε4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B in vivo (αρχειακό βιοπτικό υλικό) σε καρκίνους παχέος εντέρου και πνεύμονα; 2) Υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της UBE4B και της έκφρασης του “αγρίου τύπου” p53 (wtp53), που αποτελεί το κύριο υπόστρωμα του ενζύμου σε ιστούς παχέος εντέρου και πνεύμονα; 3) Πού οφείλεται η αύξηση της έκφρασης της UBE4B που παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των εξεταζόμενων ιστών στον καρκίνο σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό; 4) Εκφράζεται η λιγάση UBE4B σε πρώιμα στάδια κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και εκείνου της κεφαλής και τραχήλου; 5) Τί συμβαίνει με την έκφραση της σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μετά από επαγόμενη πρόκληση βλαβών στο DNA; Παίζει κάποιο ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA και στην απόπτωση;Οι απαντήσεις στα παραπάνω ερωτήματα παρουσιάζονται αναλυτικά στο 3ο Κεφάλαιο. Συμπερασματικά ωστόσο θα λέγαμε ότι από τη συγκεκριμένη μελέτη προκύπτουν βάσιμες ενδείξεις που καθιστούν τη λιγάση UBE4B ως έναν νέο και δυνητικά υποψήφιο ογκογόνο παράγοντα ο οποίος υπερεκφράζεται από τα πρώτα κιόλας καλοήθη στάδια στην πορεία της καρκινογένεσης σε παχύ έντερο και πνεύμονα. Το γεγονός αυτό φαίνεται πως οφείλεται στα αυξημένα επίπεδα mRNA ή και σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε επίπεδο πρωτεΐνης. Σε συνάρτηση με άλλες επιστημονικές μελέτες που εστιάζονται στη διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης UBE4B σε επιδιορθωτικούς μηχανισμούς, η συγκεκριμένη εργασία αναδεικνύει το συγκεκριμένο μόριο ως ένα σημαντικό παράγοντα στα πλαίσια του μηχανισμού απόκρισης γενωμικών βλαβών (DDR) όπως επίσης και της μοριακής καρκινογένεσης. Τέλος περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου της Ε3,4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στην καρκινογένεση καθίσταται αναγκαία ενώ αποτελεί ένα πρωτότυπο και πολλά υποσχόμενο πεδίο έρευνας που θα μπορούσε να ενισχύσει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης αυτής σε μελλοντικές θεραπευτικές παρεμβάσεις με πιθανά σημαντικό κλινικό αντίκτυπο.