Διερεύνηση μηχανισμών που εμπλέκονται στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της α-συνουκλεΐνης

Abstract

A-synuclein (SNCA) is a protein mainly expressed in the nervous system, having an important role in neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease (PD) and other neurodegenerative diseases known as synucleopathies. SNCA is the major component of Lewy body (LB) in the sporadic form of Parkinson's disease and dementia with LB. Several point mutations as well as duplications or triplications of the SNCA genetic locus have been identified in a number of families with an autosomal dominant form of the disease. Its physiological role is not fully established; although it is likely to be involved in synaptic neurotransmission.Aim of this dissertation is to study the post-transcriptional and translational regulation of SNCA expression through the 3' and 5' untranslated regions of its mRNA. RNA Binding Proteins (RBPs) have important functions in the post-transcriptional regulation of gene expression. RBPs bind to 3’ untranslated (3'UTR) regions of the mRNAs and may affect their degradation, stability, and / or polyadenylation. RBPs may also regulate alternative splicing or the suttling between the nucleus and the cytoplasm. They may also suppress translation by either binding to the 5' untranslated region (5'UTR), or the coding region or the 3'UTR. Based on the above, in the present study, the existence of such structural elements at the 5'UTR of the SNCA mRNA and the possible regulation of SNCA protein levels after interaction with RBPs such as Hu protein family and the AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1) are studied.First, using bioinformatics analysis, it was found that the SNCA 5'UTR is more than twice as long compared to the mean human 5’UTR length and contains a high GC percentage, indicating that it is likely to fold into elaborate RNA secondary structures.In order to study the effect of SNCA 5'UTR in the protein levels, two kinds of expression constructs were prepared; the first one contained coding and both 5’- and 3-UTR regions and the second one contained the coding and the 3-UTR region of human SNCA gene. These expression constructs were then transiently transfected into Neuro-2a cells, that express barely detectable endogenous SNCA, and the protein levels were analyzed. It was found that 5’UTR induced a 100% increase of SNCA protein levels. To further address the role of the SNCA 5’UTR in translation regulation, the SNCA 5’UTR was cloned ahead of the Renilla luciferase gene in the psiCHECK2 dual reporter vector. The inclusion of SNCA, increased Renilla luciferase levels with no effect on the levels of Renilla mRNA.Taken together, these data suggested that the 5’ UTR of SNCA mRNA possesses element(s) like IRES, IRE and G-q motifs. However, IRE and G-q motifs were not detected or, likely, are negative regulators of SNCA expression. Also, SNCA 5'UTR displays no cryptic promoter activity and does not mediate nuclear export or stabilization of SNCA mRNA. Therefore, potential IRES activity was examined as, IRES elements are typically long, GC-rich, stable RNA secondary structures that recruit the 40S ribosomal subunit in a cap-independent manner. For that reason, HEK293 and Neuro2A cells were treated with rapamycin, which is a chemical inhibitor of the mTORC1 signaling pathway. Analysis of endogenous SNCA mRNA levels showed no significant difference between untreated and rapamycin treated cells whereas, protein levels of SNCA were increased in the presence of rapamycin. Also, an increase in downstream firefly luciferase was observed with the SNCA 5’ UTR after rapamycin treatment. As a conclusion, it appears that the SNCA mRNA is translated even in conditions where cap-dependent translation is inhibited, indicating the presence of IRES activity in the 5'UTR, whereas the full length of 5’ UTR is required for optimal IRES activity. It is known that genes that have IRES activity sustain expression under stress conditions. Consequently, human cell lines were treated with oxidative factors associated with Parkinson's disease. The results showed that depolarization with KCl and treatment with 6-OHDA, MPP + and FeSO4 increase the endogenous protein levels of SNCA without effecting mRNA levels. In order to study the effect of SNCA 5'UTR in the protein levels, under these stress conditions, the expression constructs containing or not SNCA 5’ UTR, were transfected into Neuro-2a cells and it was found that the SNCA 5’ UTR is a positive mediator of translation during cellular stress.In addition, possible binding motifs of Hu and AUF1 proteins on SNCA mRNA were revealed by bioinformatic analysis. Indeed, RNA immunoprecipitation experiments showed binding of these proteins to SNCA, and a reduction of SNCA protein levels was observed after overexpression of HuR, HuB, HuC and AUF1 proteins in HEK 293 cells while, SNCA mRNA levels are decreased only by the AUF1. Also, overexpression of Hu proteins in SH-SY5Y cells reduced the endogenous SNCA protein while, overexpression of AUF1 in SK-N-SH cells decreased both SNCA endogenous protein and mRNA levels. Moreover, Hu are negatively correlated with SNCA mRNA in several regions of mouse brain like cortex and midbrain.Recent studies have shown that Parkinson’s disease pathogenesis is related to the length of 3'UTR mRNA. Patient’s samples exhibit a higher proportion of mRNA with a the long 3’UTR (2,550 bases). In pathological conditions, the 3’UTR length is also related with the accumulation of SNCA. Thus, the possible effect of Hu and AUF1 proteins on the regulation of alternative polyadenylation of SNCA mRNA has also been studied. It was found that only HuC and HuD may regulate polyadenylation in HEK293 cells as they promote the long 3'UTR. Overall, it appears that the post-transcriptional regulation of α-synuclein is mediated by proteins that bind to the 3 'UTR of its mRNA and inhibit its translation, as well as by 5'UTR which, on the contrary, enhances translation of mRNA in both normal and stress conditions. In addition, it was found that the 5'UTR of the α-synuclein mRNA contains IRES activity indicating that is translated regardless the cap mechanism.

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια πρωτεΐνη, που εκφράζεται κυρίως στο νευρικό σύστημα και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις, όπως είναι η νόσος του Πάρκινσον (PD) και στις νόσους γνωστές με τον όρο α-συνουκλεϊνοπάθειες. Συγκεκριμένα, η α-συνουκλεΐνη αποτελεί κύριο συστατικό των σωμάτιων Lewy (LB) στη σποραδική μορφή της νόσου του Πάρκινσον και στην άνοια με LB. Μέχρι σήμερα, έχουν εντοπιστεί σημειακές μεταλλάξεις και διπλασιασμοί ή τριπλασιασμοί του γενετικού τόπου της α-συνουκλεΐνης σε οικογένειες με αυτοσωμική επικρατή μορφή της νόσου. Η φυσιολογική της λειτουργία δεν είναι πλήρως εξακριβωμένη ωστόσο είναι πιθανό να εμπλέκεται στη συναπτική νευροδιαβίβαση. Στόχος της διατριβής είναι η μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης της α-συνουκλεΐνης σε μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο μέσω του 3’ και 5’ αμετάφραστου άκρου του mRNA της. Σημαντικό ρόλο στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση φαίνεται πως έχουν οι πρωτεΐνες που προσδένονται στα mRNAs (RNA Binding Proteins, RBPs). Οι RBPs μπορούν και προσδένονται στις 3΄αμετάφραστες περιοχές (3’UTR) των mRNAs επιδρώντας στην αποικοδόμηση, σταθερότητα ή και την πολυαδενυλίωσή τους. Μπορούν επίσης να ρυθμίζουν την εναλλακτική συρραφή ή την έξοδο του mRNA στόχου από τον πυρήνα και να καταστέλλουν τη μετάφραση είτε μέσω σύνδεσης στο 5’ αμετάφραστο άκρο (5’UTR) είτε μέσω της κωδικοποιούσας περιοχής είτε μέσω του 3’ αμετάφραστου άκρου (3’UTR). Όσον αφορά το 5’UTR και την επίδρασή του στη διαδικασία της μετάφρασης, έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα τα στοιχεία απόκρισης στον σίδηρο (Iron-Responsive Elements, IREs), οι τετραπλές δομές πλούσιες σε γουανίνη (G-quadruplex structures, δομές G-q) και οι εσωτερικές θέσεις πρόσδεσης ριβοσώματος (Internal Ribosome Entry Sites, IRESes) που επιδρούν στην μετάφραση. Έτσι, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ύπαρξη τέτοιων δομών και στοιχείων στο 5’UTR του mRNA της α-συνουκλεΐνης αλλά και η ρύθμιση των πρωτεϊνικών επιπέδων της μετά από αλληλεπίδραση με RBPs όπως η οικογένεια των πρωτεϊνών Hu και ο παράγοντας πρόσδεσης σε περιοχές πλούσιες σε Αδενίνη και Ουρακίλη (A+U-Rich Element Binding Factor 1, AUF1).Στα πλαίσια της μελέτης του 5’UTR, με βιοπληροφορική ανάλυση, διαπιστώθηκε ότι το μήκος του είναι σχεδόν δύο φορές μεγαλύτερο σε σχέση με το μέσο μήκος του 5’UTR των θηλαστικών και περιέχει νουκλεοτίδια G και C σε μεγάλο ποσοστό, υποδεικνύοντας πως είναι πιθανόν να σχηματίζει μια περίπλοκη δευτεροταγή διαμόρφωση.Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του 5’UTR στα πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος Neuro2A, η οποία δεν εκφράζει ενδογενώς την α-συνουκλεΐνη, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση πλασμιδίων που φέρουν την α-συνουκλεΐνη με ή χωρίς το 5’UTR. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν σχεδόν 100% αύξηση της έκφρασής της παρουσία του 5’UTR, χωρίς όμως να μεταβάλλονται τα επίπεδα του mRNA. Με στόχο να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος του 5’UTR της α-συνουκλεΐνης, κλωνοποιήθηκε το συγκεκριμένο τμήμα ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης. Μέτρηση δραστικότητας λουσιφεράσης αποκάλυψε ενίσχυση της μετάφρασης, χωρίς πάλι να μεταβάλλονται τα επίπεδα του υβριδικού mRNA. Τα παραπάνω δεδομένα υπέδειξαν την ύπαρξη δευτεροταγών δομών στο 5’UTR της α-συνουκλεΐνης, δυνητικά τα μοτίβα IRES, IRE και G-q. Ωστόσο, τα IRE και G-q μοτίβα δεν ανιχνεύθηκαν ή φάνηκαν να είναι αρνητικοί ρυθμιστές της μετάφρασης της α-συνουκλεΐνης. Ακόμα, το 5’UTR δεν βρέθηκε να διαθέτει δραστικότητα «κρυφού» υποκινητή, να βελτιώνει την έξοδο του mRNA από τον πυρήνα, ή να ενισχύει τη σταθερότητα του μεταγράφου. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε, επίσης, η ύπαρξη ενεργότητας IRES στο 5’UTR της α-συνουκλεΐνης. Τα 5’UTR που έχουν ενεργότητα IRES, συνήθως, έχουν μεγάλο μήκος, μεγάλο ποσοστό σε γουανίνη-κυτοσίνη, σταθερές δευτεροταγείς διαμορφώσεις και μεταφράζονται ανεξάρτητα από τον μηχανισμό της καλύπτρας. Συνεπώς, το πρώτο βήμα ήταν να διερευνηθεί αν η α-συνουκλεΐνη μεταφράζεται ακόμα και όταν αναστέλλεται η μετάφραση μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε ραπαμυκίνη, ένας χημικός αναστολέας του σηματοδοτικού μονοπατιού mTORC1 που επάγει τη μετάφραση, σε κύτταρα HEK293 και Neuro2A. Από τα πειράματα αυτά φάνηκε αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης, χωρίς να μεταβάλλονται τα επίπεδα του mRNΑ. Ομοίως, διαπιστώθηκε ενίσχυση της έκφρασης της υβριδικής λουσιφεράσης μετά από έκθεση σε ραπαμυκίνη όταν ανοδικά του γονιδίου της υπήρχε το 5’ UTR της α-συνουκλεΐνης. Συμπερασματικά, φαίνεται πως το mRNA της α-συνουκλεΐνης μεταφράζεται ακόμα και σε συνθήκες αναστολής της μετάφρασης μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας, υποδεικνύοντας την ύπαρξη ενεργότητας IRES στο 5’UTR. Πειράματα εντοπισμού της δομής IRES αποκάλυψαν πως απαιτούνται όλες οι βάσεις για να είναι πλήρης η ενεργότητά της. Είναι γνωστό πως τα γονίδια που έχουν ενεργότητα IRES εκφράζονται σε μεγαλύτερο βαθμό υπό συνθήκες στρες. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε τιτλοδότηση της επίδρασης οξειδωτικών παραγόντων, σχετιζόμενων με τη νόσο του Πάρκινσον, σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η εκπόλωση με KCl και οι οξειδωτικοί παράγοντες 6-OHDA, MΡΡ+ και FeSO4 μπορούν να προκαλέσουν αύξηση των ενδογενών πρωτεϊνικών επιπέδων της α-συνουκλεΐνης, χωρίς να μεταβάλλουν τα επίπεδα του mRNA. Προσθήκη των ίδιων παραγόντων σε κύτταρα Neuro2A, που υπερεκφράζουν την α-συνουκλεΐνη με ή χωρίς το 5’UTR, αποκάλυψε πως η παρουσία του 5’UTR είναι θετικός ρυθμιστής της μετάφρασης σε συνθήκες στρες.Ακολούθως, εντοπίστηκαν περιοχές πιθανής αλληλεπίδρασης του mRNA της α-συνουκλεΐνης με τις πρωτεΐνες Hu και AUF1, μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης. Πράγματι, τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης RNA αποκάλυψαν σύνδεση του 3’UTR της α-συνουκλεΐνης με αυτές τις πρωτεΐνες και έτσι, μελετήθηκε η επίδραση αυτών στα πρωτεϊνικά επίπεδά της. Αποκαλύφθηκε πως οι HuR, HuB, HuC και AUF1 μειώνουν τα πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά HEK293, ενώ τα επίπεδα του mRNA μειώθηκαν μόνο μετά την επίδραση της AUF1. Επίσης, επιμόλυνση με αδενοϊούς που υπερεκφράζουν τις Hu μείωσε τα ενδογενή πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά SH-SY5Y. Ομοίως, αποδείχθηκε μείωση της ενδογενούς πρωτεΐνης και των επιπέδων mRNA της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά SK-N-SH, μετά από υπερέκφραση της AUF1. Συγκρίνοντας τα πρότυπα έκφρασης των mRNAs των Hu με την α-συνουκλεΐνη σε εγκεφάλους μυών, βρέθηκε πως υπάρχει αρνητική συσχέτιση σε περιοχές όπως ο φλοιός και ο μεσεγκέφαλος. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πως το μήκος του 3’UTR σχετίζεται με την παθογένεια της PD. Δείγματα ασθενών εμφανίζουν υψηλότερη αναλογία του mRNA της α-συνουκλεΐνης με μεγάλο μήκος 3΄UTR (2,550 βάσεις) σε σχέση με το μικρού μήκους. Επίσης, το μήκος του 3΄UTR φαίνεται να σχετίζεται με τη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης σε παθολογικές καταστάσεις. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε και η επίδραση των Hu και AUF1 στη ρύθμιση της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης του mRNA της α-συνουκλεΐνης. Φάνηκε πως μόνο οι HuC και ΗuD μπορεί να αποτελούν ρυθμιστές της πολυαδενυλίωσης στην κυτταρική σειρά HEK293 καθώς ευνοούν την ύπαρξη του μεγάλου μήκους 3’UTR. Συνολικά, φαίνεται πως η μετα-μεταγραφική ρύθμιση της α-συνουκλεΐνης διαμεσολαβείται τόσο από πρωτεΐνες που συνδέονται με το 3’UTR του mRNA της και παρεμποδίζουν την μετάφρασή του, όσο και από το 5’UTR που -αντίθετα-, ενισχύει τη μετάφραση του mRNA της, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες. Επιπλέον διαπιστώθηκε πώς το 5’UTR της α-συνουκλεΐνης εμπεριέχει δραστικότητα IRES γεγονός που σημαίνει πως το mRNA της α-συνουκλεΐνης μεταφράζεται ακόμα και σε συνθήκες αναστολής της μετάφρασης μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας.