Ανάπτυξη βιοαισθητήρα για την ταχεία ανίχνευση ορμονών και τοξινών με εφαρμογή σε τρόφιμα και ύδατα

Abstract

Biosensors are self-contained integrated devices capable to provide analytical information using biological recognition molecules in direct spatial contact with a transducer. Nanotechnology has offered a method for preparing nanosensors based on lipid membranes by using graphene electrodes. Biosensors that are based on lipid membranes provide many advantages over thestandard analytical methods, including rapid responsetimes, small size, low cost, time efciency, portability for use in the eld, and most importantly,biosensors are biocompatible.Research is now being directed to the use of nanotechnological advance to construct portable nanosensors with better characteristics that can be used for the eld and in situ determination of analytes, such as phytohormones, allergens, antibiotics, polycyclic aromatic hydrocarbons and other toxicants in foods and the environment, which will in turn improve human safety.In the present Ph. D. thesis, a standard electrochemical biosensor was first developed to determine Naphthalene Acetic Acid (NAA) in fruits and vegetables. This biosensor was made by depositing graphene nanosheets on a copper wire placed on a glass fiber filter and immobilized lipid membrane with incorporated the Auxin- binding protein (ABP-1) receptor to determine the NNA. The flow injection system in aliquots of aqueous NNA solutions was used. The sensor showed a highly stable output has along with a good linear sensitivity curve over a large dynamic range from 50×10−9 M to 10×10−6 M of NAA at pH 7,0. The detection limit was 10 nM of NAA and the response times were about 5 minutes. The device can be manufactured very easily, has extremely reproducible results and can be reused many times. The shelf life was very long and the slope of the potentiometric nanoscale was 56 mV / decade of NAA concentration. The evaluation / validation of this biosensor was made by spiked using fruit and vegetables.A second miniaturized potentiometric biosensor was developed for the detection of Saxitoxin (STX) using flow injection for aqueous fractions of STX. This biosensor was prepared, like previously for NAA, by deposition in copper wire of graphene layers on a glass fiber filter with integrated lipid membranes and Anti-STX, the native saxitoxin receptor, immobilized on the stabilized lipid membranes. The sensor showed fast response times (5-20 minutes) and good linear sensitivity curve over a large dynamic range from 1 × 10-9 M to 1 × 10-6 M as STX at pH 7.0. The detection limit, based on the lowest concentration that could be measured reliably (S / N = 3), was 1 nM. The proposed sensor is easy to manufacture and has good reproducibility, reusability, selectivity, long life and high sensitivity of about 60 mV / decade toxin concentration. The suitability of the sensor we developed was further verified on STX‐spiked lake water samples and in fresh shellfish samples.

Οι βιοαισθητήρες είναι αυτοτελείς ενσωματωμένες συσκευές ικανές να παρέχουν αναλυτικές πληροφορίες χρησιμοποιώντας μόρια βιολογικής αναγνώρισης σε άμεση χωρική επαφή με μεταλλάκτη. Η νανοτεχνολογία έχει προσφέρει μια μέθοδο για την παρασκευή νανοαισθητήρων με βάση λιπιδικές μεμβράνες χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια γραφενίου. Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται σε λιπιδικές μεμβράνες παρέχουν πολλά πλεονεκτήματα έναντι των τυπικών αναλυτικών μεθόδων, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου ταχείας απόκρισης, το μικρό μέγεθος, το χαμηλό κόστος, τη χρονική αποτελεσματικότητα, τη φορητότητα για χρήση στο πεδίο. Η έρευνα τώρα κατευθύνεται προς τη χρήση της νανοτεχνολογικής προόδου για την κατασκευή φορητών νανοαισθητήρων με καλύτερα χαρακτηριστικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον καθορισμό και επιτόπιο προσδιορισμό αναλυτών, όπως φυτορμόνες, αλλεργιογόνα, αντιβιοτικά, πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, και άλλες τοξικές ουσίες στα τρόφιμα και στο περιβάλλον. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ'αρχήν ένας πρότυπος ηλεκτροχημικός βιοαισθητήρας για τον προσδιορισμό του Ναφθαλενικού Οξικού Οξέος (NAA) σε φρούτα και λαχανικά. Αυτός κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανόφυλλων γραφενίου πάνω σε σύρμα χαλκού τοποθετημένου επί ενός φίλτρου από υαλώδεις ίνες και ακινητοποιημένη λιπιδική μεμβράνη με ενσωματωμένους τους υποδοχείς δέσμευσης της πρωτεΐνης- αυξίνης (ΑΒΡ1) για τον προσδιορισμό του ΝNA. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα έγχυσης ροής σε κλάσματα υδατικών διαλυμάτων ΝΝΑ. Ο αισθητήρας έδειξε εξαιρετικά σταθερή απόδοση μαζί με καλή γραμμική καμπύλη ευαισθησίας σε μεγάλη δυναμική περιοχή από 50 x10-9M έως 10x10-6M NAA σε pH 7,0. Το όριο ανίχνευσης, ήταν 10 nΜ ΝΑΑ και οι χρόνοι απόκρισης ήταν περίπου 5’. Η συσκευή μπορεί να κατασκευαστεί πολύ εύκολα, έχει εξαιρετικά αναπαραγώγιμα αποτελέσματα και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί πολλές φορές. Η διάρκεια ζωής ήταν πολύ μεγάλη και η κλίση του ποτενσιομετρικού νανοαισθητήρα ήταν 56 mV / δεκάδα συγκέντρωσης NAA. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένας δεύτερος μικροσκοπικός ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση Σαξιτοξίνης (STX) χρησιμοποιώντας έγχυση ροής για υδατικά κλάσματα STX. Ο βιοαισθητήρας αυτός παρασκευάστηκε με εναπόθεση σε σύρμα χαλκού στοιβάδων γραφενίου σε φίλτρο από υαλώδεις ίνες με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες και η αντι-STX (ο φυσικός υποδοχέας σαξιτοξίνης) ακινητοποιημένη στις σταθεροποιημένες λιπιδικές μεμβράνες. Ο αισθητήρας έδειξε γρήγορους χρόνους απόκρισης (5-20 λεπτά) και καλή καμπύλη γραμμικής ευαισθησίας σε μεγάλη δυναμική περιοχή από 1 × 10-9 M έως 1 × 10-6 M ως STX σε pH 7,0. Το όριο ανίχνευσης, με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που μπορεί να μετρηθεί αξιόπιστα (S/N = 3), βρέθηκε 1nM. Ο προτεινόμενος αισθητήρας είναι εύκολος στην κατασκευή και έχει καλή αναπαραγωγιμότητα, επαναχρησιμοποίηση, επιλεκτικότητα, μεγάλη διάρκεια ζωής και υψηλή ευαισθησία συγκέντρωσης περίπου 60 mV / δεκάδα. Η καταλληλότητα του αισθητήρα που αναπτύξαμε επαληθεύθηκε περαιτέρω σε δείγματα νερού λίμνης εμβολιασμένα με STX και σε δείγματα νωπών οστρακοειδών.