Μελέτη μοριακών μηχανισμών ρύθμισης της γήρανσης και της μακροβιότητας

Abstract

The development of multicellular organisms is characterized by irreversible changes of their anatomy, their physiology and their ability of adaptation to the environment. These changes, that can either be gradual or not, increase the possibility of death. The cascade of these developmental stages, with death being the last stage, is called ageing. It is a ubiquitous phenomenon that appears in all organisms. During the progression of ageing, changes in the morphology, the physiology and the molecular characteristics of the cells occur. Degradation and more precisely, the proteolytic mechanisms of the cell are playing a fundamental role in the maintenance of cellular homeostasis. These mechanisms are subjected to changes during ageing. The proteasome is the main cellular proteolytic machinery. In humans, the proteasome is composed by 14 α-regulatory subunits and 14 β-catalytic subunits (α7β7β7α7). It is responsible for the degradation of damaged proteins (unfolded, oxidized proteins etc) as well as, for the degradation of normal proteins that need to be proteolysed. However, it is not clear what is happening in the mechanism of the proteasome during ageing and its progression. The aim of this thesis is the study of the basic cellular proteolytic system, the proteasome, along with its expression profile and its role regarding its function, during the progression of ageing and longevity, in vivo and in vitro. We have shown that the protein expression levels of the proteasome subunits along with the proteasome function (studied mainly through the specific proteasome activities) are altered. These alterations may be related to the in vivo ageing and its progression. By using the model of cells from healthy donors of different ages (human fibroblasts derived from healthy donors of different ages, including centenarians), it became obvious that the RNA levels and the protein expression levels of several proteasome subunits (mainly α-regulatory and β-catalytic subunits of the 20S complex), along with the proteasome activities, were found decreased with donors age (18, 28 and 80 years old donors). The decreased proteasome activities of the cells derived from older donors were directly linked to the high levels of oxidised proteins exhibited by those cells. Given the fact that in the ageing research, healthy centenarians represent the best characterised living examples of successful ageing, fibroblasts derived from healthy centenarians were included in this study. The RNA and protein expression levels of the examined proteasome subunits in centenarians cultures were found similar to the levels expressed by the young donors cultures (28 years old) rather than the old donors cultures (80 years old). This profile is also maintained when the levels of proteasome activities of these cells are examined. Given the fact that the best model of studying ageing in vitro is represented by human normal cells that senesce in vitro, fibroblasts derived from healthy adult donors of different ages were cultured until the point of irreversible cease of proliferation (irreversible growth arrest) and their proteasome profile was studied. The RNA and protein expression levels and simultaneously, their levels of proteasome activities exhibited a decrease along with the in vitro ageing of the cells. .............................................................

Η αναπτυξιακή πορεία όλων των πολυκύτταρων οργανισμών περιλαμβάνει διάφορα στάδια, τα οποία χαρακτηρίζονται από μη αντιστρεπτές μεταβολές, στην ανατομία, στη φυσιολογία αλλά και στην προσαρμοστικότητα αυτών, οι οποίες αυξάνουν την πιθανότητα θανάτου. Οι μεταβολές που υφίσταται κάθε οργανισμός μπορεί να είναι απότομες ή και βαθμιαίες. Το φαινόμενο αυτό της αλληλοδιαδοχής διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων, με τελικό στάδιο το θάνατο, καλείται γήρανση. Πρόκειται για καθολικό φαινόμενο που εμφανίζεται σε όλους τους οργανισμούς, κατά την εξέλιξη του οποίου, εμφανίζονται διάφορες αλλαγές στη μορφολογία, τη φυσιολογία και τα μοριακά χαρακτηριστικά των δομικών λίθων των οργανισμών, τα κύτταρα. Η αποικοδόμηση και οι πρωτεολυτικοί μηχανισμοί του κυττάρου αποτελούν συστήματα που παίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιοστασίας και που υφίστανται τροποποιήσεις κατά την εξέλιξη του φαινομένου της γήρανσης. Το πρωτεόσωμα αποτελεί τον βασικό κυτταρικό πρωτεολυτικό μηχανισμό. Στα ανθρώπινα κύτταρα, το πρωτεόσωμα αποτελείται από 14 α-ρυθμιστικές υπομονάδες και 14 β-καταλυτικές υπομονάδες σε διάταξη α7β7β7α7. Είναι υπέυθυνο για την αποικοδόμηση τόσο κατεστραμμένων πρωτεϊνών (αποδιαταγμένων, οξειδωμένων κλπ), όσο και φυσιολογικών πρωτεϊνών που πρέπει να πρωτεολυθούν. Παρόλο ότι υπάρχουν πολλά δεδομένα τόσο για τη γήρανση όσο και για το πρωτεόσωμα, δεν είναι πλήρως γνωστό το τι συμβαίνει στον μηχανισμό αυτού κατά τη γήρανση και την εξέλιξή της. Σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής είναι η μελέτη του βασικού πρωτεολυτικού συστήματος του κυττάρου, του πρωτεοσώματος και η συσχέτιση της έκφρασης και δράσης αυτού με το φαινόμενο της γήρανσης και της μακροβιότητας στον άνθρωπο, in vivo και in vitro. Δείχθηκε πως κατά την in vivo γήρανση, το πρωτεόσωμα υφίσταται αλλαγές τόσο σε επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης των υπομονάδων του όσο και σε επίπεδο λειτουργικότητας αυτού (μελετώντας τις πρωτεολυτικές του ενεργότητες). Οι μεταβολές αυτές μπορούν να σχετισθούν με την in vivo γήρανση και την εξέλιξη αυτής. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο των δοτών διαφορετικών ηλικιών (ανθρώπινοι ινοβλάστες από υγιείς δότες διαφορετικών ηλικιών), έγινε φανερό πως μεταβαίνοντας από κύτταρα δοτών μικρής ηλικίας (18, 28 ετών) σε κύτταρα δοτών μεγάλης ηλικίας (80 ετών), παρατηρείται μείωση των επιπέδων, τόσο RNA όσο και πρωτεϊνικής έκφρασης, των διαφόρων πρωτεοσωμικών υπομονάδων (η μελέτη έγινε με έμφαση στις υπομονάδες του 20S συμπλόκου, τόσο α-ρυθμιστικές όσο και β-καταλυτικές), όσο και των πρωτεοσωμικών ενεργοτήτων αυτού. Οι μειωμένες ενεργότητες του πρωτεοσώματος στους ινοβλάστες ατόμων μεγάλης ηλικίας έχουν άμεσο αντίκτυπο στα παρατηρούμενα επίπεδα οξειδωμένων κυτταρικών πρωτεϊνών, τα οποία παρουσιάζονται αυξημένα στα κύτταρα αυτά. Δεδομένου ότι στο πεδίο της γήρανσης, οι υγιείς αιωνόβιοι αποτελούν χαρακτηριστικά παραδείγματα «επιτυχούς» γήρανσης, συμπεριλήφθησαν στην παραπάνω μελέτη και ινοβλάστες από ανάλογους δότες. Τα επίπεδα RNA και πρωτεϊνικής έκφρασης των διαφόρων πρωτεοσωμικών υπομονάδων αυτών των κυττάρων, βρέθηκαν παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στα κύτταρα δοτών νεαρής ηλικίας (28 ετών) και όχι δοτών μεγαλύτερης ηλικίας (80 ετών). ................................................................