Μελέτη της αντικαρκινικής φαρμακολογικής δράσης υβριδικών-χιμαιρικών αζωτούχων στεροειδών παραγόντων και της επίδρασής τους στις μοριακές οδούς RAS-RAF-MEK-ERK και RAS-PI3K-AKT

Abstract

This Ph.D. thesis concerns the study of the anticancer pharmacological action of hybrid-chimeric nitrogenous steroidal agents and their effect on the molecular pathways RAS-RAF-MEK-ERK and RAS-PI3K-AKT.The discovery of small molecules of inhibitors of various proteins or genes that play an important role at various points of the signal transduction pathways responsible for the progression and progression of cancer is very important for the development of new anticancer drugs.Alkylating agents as drugs are highly toxic to the body and cause many side effects in patients, affecting their quality of life. In the process, it has been found that the addition of a steroid to the alkylating agents reduces their toxicity and increases the therapeutic effect. This is due to the lipophilic nature of steroids acting as drug transporters, which results in greater concentration of the alkylating agent in the cell.Thus, bifunctional organic hybrid steroid molecules have been designed and synthesized so that chemical modification of their conjugated portions enables them to attack and bind more specifically and efficiently with particular proteins to the two intracellular signal transduction pathways reported by inhibiting their action. This is accomplished by binding them to the target protein binding site from both pathways. In particular, the steroid-to-conjugate moieties were synthesized in such a way as to have a lactam ring inside them which would be -A or -D (monolactam), as well as two lactam rings, -A and -C-ring of the steroidal skeleton (dilactamas), starting from three precursor steroids, testosterone, estrone and adrenosterone. It has been found that the addition of lactam to the steroid gives cytotoxic activity because it interacts with the proteins and nucleic acids of the cell.Also, one of the most important findings with an in vitro cytostatic and cytotoxicity study is that the hybrid compounds exhibit greater activity and less toxicity than their alkylating / cytotoxic moieties.To investigate the mechanism of action of the compounds, a wide range of chemical, biochemical and cellular techniques, as well as in silico techniques of computational chemistry and molecular modeling were used. In particular, simulation studies using molecular docking techniques were conducted to determine the ability of hybrid compounds to inhibit proteins and enzymes involved in the pathways reported. ADME / Tox (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion & Toxicity) prediction studies have also been conducted based on modern molecular simulation methods to predict the pharmacokinetic profile of the compounds and their activity as drugs.Finally, the mechanism of action study was completed by Western Blot and ELISA molecular techniques. At the same time, using the flow cytometry, the mechanism of apoptosis was studied and a cell cycle study was performed on the effect of the compounds on specific cell lines. Finally, the mechanism of action of the studied compounds in AKT1 / 2 and ERK1 / 2 proteins by intracellular flow cytometry was further investigated.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφορά τη μελέτη της αντικαρκινικής φαρμακολογικής δράσης υβριδικών-χιμαιρικών αζωτούχων στεροειδικών παραγόντων και την επίδρασή τους στις μοριακές οδούς RAS-RAF-MEK-ERK και RAS-PI3K-AKT. Η ανεύρεση μικρών μορίων αναστολέων διαφόρων πρωτεϊνών ή γονιδίων τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορα σημεία των δρόμων μεταγωγής σήματος υπεύθυνων για την πρόοδο και εξέλιξη του καρκίνου, είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Οι αλκυλιωτές σαν φάρμακα, είναι ιδιαίτερα τοξικά για τον οργανισμό και προκαλούν πολλές παρενέργειες στους ασθενείς με αποτέλεσμα να επηρεάζουν την ποιότητα ζωής τους. Στην πορεία, έχει βρεθεί ότι η προσθήκη ενός στεροειδούς στους αλκυλιωτές μειώνει την τοξικότητά τους και αυξάνει το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Αυτό συμβαίνει λόγω της λιπόφιλης φύσης των στεροειδών που λειτουργούν σαν μεταφορείς φαρμάκων γεγονός το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την μεγαλύτερη συγκέντρωση του αλκυλιωτή μέσα στο κύτταρο. Έτσι, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν διλειτουργικά (bifunctional) οργανικά υβριδικά στεροειδικά μόρια, ώστε η χημική τροποποίηση των συζευγμένων τμημάτων τους να τους δώσει τη δυνατότητα να προσβάλλουν και να συνδεθούν πιο εξειδικευμένα και αποτελεσματικά με συγκεκριμένες πρωτεΐνες στις δύο ενδοκυττάριες οδούς μεταγωγής σήματος που αναφέρθηκαν, αναστέλλοντας τη δράση τους. Αυτό επιτυγχάνεται με την πρόσδεσή τους στη θέση σύνδεσης πρωτεϊνών-στόχων και από τα δύο μονοπάτια. Συγκεκριμένα, τα στεροειδικά προς σύζευξη τμήματα συντέθηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε να διαθέτουν έναν λακταμικό δακτύλιο στο εσωτερικό τους, ο οποίος θα είναι ο –Α ή ο –D (μονολακτάμες), καθώς και δύο λακταμικούς δακτυλίους, ο –Α και ο –C δακτύλιος του στεροειδικού σκελετού (διλακτάμες), ξεκινώντας από τρία πρόδρομα στεροειδή, την τεστοστερόνη, την οιστρόνη και την αδρενοστερόνη.Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη λακτάμης στο στεροειδές προσδίδει κυτταροτοξική δράση διότι αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα του κυττάρου.Επίσης, από τις πλέον σημαντικότερες διαπιστώσεις που προέκυψαν με in vitro μελέτη κυτταροστατικότητας και κυτταροτοξικότητας, είναι οτι οι υβριδικές ενώσεις παρουσιάζουν μεγαλύτερη δραστικότητα και μικρότερη τοξικότητα από τα αλκυλιωτικά/κυτταροτοξικά τμήματά τους. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε ένα ευρύ φάσμα χημικών, βιοχημικών και κυτταρικών τεχνικών, καθώς και in silico τεχνικών υπολογιστικής χημείας και τεχνικών μοριακής μοντελοποίησης. Ιδιαίτερα πραγματοποιήθηκαν πειράματα Μοριακής Πρόσδεσης (Μolecular Docking) ώστε να διαπιστωθεί η ικανότητα των υβριδικών ενώσεων να αναστέλλουν πρωτεΐνες και ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στα μονοπάτια που έχουν αναφερθεί. Επίσης, έγιναν μελέτες πρόβλεψης ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) χρησιμοποιώντας αξιόπιστα υπολογιστικά εργαλεία για την πρόβλεψη του φαρμακοκινητικού προφίλ των ενώσεων και της δράσης τους ως φάρμακα.Τέλος, η ολοκλήρωση της μελέτης του μηχανισμού δράσης πραγματοποιήθηκε με μοριακές τεχνικές WesternBlot και ELISA. Παράλληλα, με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής μελετήθηκε ο μηχανισμός απόπτωσης ενώ έγινε και μελέτη του κυτταρικού κύκλου κατά την επίδραση των ενώσεων σε συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές. Τέλος διερευνήθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης των υπό μελέτη ενώσεων στις πρωτεΐνες AKT1/2 και ERK1/2 με ενδοκυττάρια κυτταρομετρία ροής.