Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων EGFR, RAS που εμπλέκονται στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα σε συμπαγείς όγκους

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed type of cancer and the fourth most common cause of cancer related death worldwide. Nowadays several clinical studies have highlighted the predictive role of gene alterations involved in the EGFR pathway. In this study we investigated the presence of KRAS / BRAF mutations and their correlation with the clinical-histopathological parameters in 322 patients with colon cancer. In addition, we collected fresh paired tumor and normal tissue from 50 patients and investigated the expression level of KRAS and EGFR gene, in mRNA transcripts using the method of real time polymerase chain reaction. Then the correlation between expression levels and various clinicopathological parameters was examined.Our study showed that frequency and distribution of KRAS and BRAF mutations in Greek population are similar to that described in previous studies. G>A transition at codon 12 of KRAS gene showed a statistically significant correlation with the absence of lymph node metastases (p<0.05). Instead, G>C transversion in the same codon, showed statistically significant correlation with the presence of lymph node metastases (p<0.005). KRAS/ BRAF p.V600E mutations were correlated with tumour location in the right colon compared to those located in the left colon and rectum (p<0.05, p<0.005 respectively). There was statistically significant correlation between the absence of KRAS mutations and high grade tumors (p<0.005).The presence of BRAF p.V600E mutation was associated with high grade tumors (p<0.005) and increased number of lymph node metastasis (N2), in patients with metastatic disease (p<0.05).According to absolute quantification method mRNA expression of KRAS/EGFR genes was higher in tumour compared to normal tissue and this finding was statistically significant (p<0.05). Among patients with lymph node involvement, mRNA expression of KRAS gene was significantly associated with the number of lymph node metastasis. We also found a positive correlation between increased mRNA expression of the EGF-receptor and the presence of the KRAS gene mutations, but not proved to be statistically significant, possibly due to small number of patients.In summary our findings confirm that tumours with right location follow different pathway of carcinogenesis compared to left located tumours. Moreover, the presence of KRAS/BRAF mutations was associated with aggressive behavior and worse survival of patients with colorectal adenocarcinomas. KRAS mRNA expression could be a candidate biomarker for assessing invasive capacity of the tumor and possible recurrence of the disease. Increased mRNA expression of the EGF-receptor in patients with KRAS mutations indicates the presence of other regulatory mechanisms beyond KRAS mutations. Assessment of expression levels may serve as a useful biomarker of prognostic and predictive value in the future.

O καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη συχνότερη μορφή καρκίνου και την τέταρτη σε συχνότητα αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Τελευταία, πλήθος μελετών έχει επισημάνει την προγνωστική/ προβλεπτική σημασία γενετικών αλλαγών σε γονίδια του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGF-υποδοχέα. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε την ύπαρξη KRAS/BRAF μεταλλάξεων και τη συσχέτισή τους με τις κλινικο-ιστοπαθολογικές παραμέτρους σε 322 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, συλλέξαμε νωπό νεοπλασματικό και φυσιολογικό ιστό από 50 ασθενείς και μελετήσαμε την έκφραση, σε επίπεδο mRNA μεταγράφων των KRAS και EGFR γονιδίων με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Από τη μελέτη μας προέκυψε ότι η συχνότητα και κατανομή των KRAS και BRAF μεταλλάξεων στον Ελληνικό πληθυσμό είναι ανάλογη με αυτή που περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες. Οι G>A νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις, στο κωδικόνιο 12 του KRAS γονιδίου, εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την απουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (p<0.05). Αντιθέτως, οι G>C νουκλεοτιδικές μεταθέσεις στο ίδιο κωδικόνιο, εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την ύπαρξη λεμφαδενικών μεταστάσεων (p<0.005). Διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των KRAS/ BRAF p.V600E μεταλλάξεων και της εντόπισης του όγκου στο δεξιό κόλον, σε σχέση με τα καρκινώματα που εντοπίζονταν στο αριστερό κόλον, συμπεριλαμβανομένου και του ορθού (p<0.05, p<0.005 αντίστοιχα). Στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p<0.005) παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ του χαμηλού βαθμού διαφοροποίησης και της απουσίας των KRAS μεταλλάξεων. Από τα δεδομένα μας, όσον αφορά στην p.V600E μετάλλαξη του BRAF γονιδίου, υπήρξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της V600E μετάλλαξης και του χαμηλού βαθμού ιστολογικής διαφοροποίησης των καρκινωμάτων παχέος εντέρου (p<0.005), καθώς και του αυξημένου αριθμού λεμφαδενικών μεταστάσεων (Ν2) (p<0.05) στους ασθενείς με μεταστατική νόσο.Με τη μέθοδο της απόλυτης ποσοτικοποίησης, η έκφραση των KRAS/ EGFR γονιδίων σε επίπεδο mRNA μεταγράφων ήταν υψηλότερη στον καρκινικό ιστό σε σχέση με το φυσιολογικό τοίχωμα του παχέος εντέρου και το εύρημα αυτό είναι στατιστικά σημαντικό (p<0.05). H έκφραση του KRAS γονιδίου έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τον αριθμό των λεμφαδενικών μεταστάσεων, στις περιπτώσεις των ασθενών με λεμφαδενική συμμετοχή. Διαπιστώθηκε επίσης, θετική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης έκφρασης του EGF-υποδοχέα και της ύπαρξης μεταλλάξεων του KRAS γονιδίου, χωρίς ωστόσο να αποδειχθεί στατιστικά σημαντική, πιθανά λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων.Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν ότι τα καρκινώματα δεξιάς εντόπισης ακολουθούν διαφορετικό μονοπάτι καρκινογένεσης σε σχέση με τα αριστερής εντόπισης καρκινώματα. Επιπλέον, η παρουσία των KRAS/BRAF μεταλλάξεων σχετίζεται με επιθετική συμπεριφορά και χειρότερη επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου. Η μέτρηση της έκφρασης των KRAS mRNA μεταγράφων θα μπορούσε να αποτελέσει έναν υποψήφιο βιοδείκτη για την εκτίμηση της μεταστατικής ικανότητας του όγκου και την παρακολούθηση (follow-up) των ασθενών στα πλαίσια πιθανής υποτροπής της νόσου. Η αυξημένη έκφραση των mRNA μεταγράφων του EGF-υποδοχέα, σε ασθενείς με KRAS μεταλλάξεις υποδηλώνει την ύπαρξη κι άλλων ρυθμιστικών μηχανισμών, πέραν των KRAS μεταλλάξεων. Ενδεχομένως η εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης να αποτελέσει στο μέλλον ένα χρήσιμο βιοδείκτη με προγνωστική ή προβλεπτική αξία.