Αξιολόγηση νέων αναστολέων του ιού της Ηπατίτιδας C και συγγενικών ιών, καθώς και βιοδεικτών απόκρισης σε θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Despite the effective treatments against Hepatitis C virus (HCV), problems still exist, such as high treatment costs, the emergence of resistant viral strains, and the co-infections with Hepatitis B Virus (HBV) and the related to HCV Dengue (DENV), Yellow Fever (YFV) and Zika (ZIKV) viruses. Moreover, the cellular mechanisms that regulate viral replication are not fully understood. Therefore, in this project a) new inhibitors against viruses of Flaviviridae family (HCV, DENV, YFV, ZIKV) and the molecular mechanisms of action were studied, and b) the role of cellular factors in viral replication and pathogenesis was investigated, to highlight new biomarkers and therapeutic targets against Flaviviridae viruses, by focusing on the signaling pathways of hypoxia, PI3K/AKT and a PI3K-binding factor, L-Dopa decarboxylase (DDC). Concerning the first objective, we tested against Flaviviridae viruses: 1) plant extracts and isolated compounds, 2) nucleoside and peptidomimetic synthetic analogues based on approved anti-HCV drugs, and 3) analogues of N-hydroxyimide and acetohydroxamic acid, which chelate divalent metal ions in the active site of viral enzymes. Specifically, we found compounds broadly active against HCV, DENV and YFV, while the flavonoid 2'-hydroxygensitein-7-O-glucopyranoside was effective against DENV (median effective concentration-EC50=6.38 μM). Nucleoside analogue 15d inhibited HCV 1b (EC50=40.22 μM), with high barrier to resistance. The resistance mutations suggest that it inhibits the interactions of NS5A. The N-hydroxyimide ZF66 had EC50=3.08 μM against HCV 1b, while exhibiting a high barrier to resistance, and possibly chelates the Mg2+ ions in the active site of NS5B polymerase. Finally, acetohydroxamic acid analogues bearing an adamantane group as a substituent, have broad activity against HCV, DENV, YFV and ZIKV), with ZB5 (HCV 1b: EC50=0.08 μM) and ZF64 (DENV: EC50=0.07 μM) being the most active. They also showed a high barrier to resistance and possibly target viral NS3 protein. Concerning the second objective, hypoxia (3% v/v O2) increased DENV RNA replication, through factors that activate under low oxygen, specifically HIF and AKT, but not PI3K. In addition, hypoxia reduced the activity of HCV and DENV inhibitors. Inversely, DENV induces HIF under atmospheric oxygen, causing a metabolic reprogramming in the host cell that favors viral proliferation. In addition, DENV and HCV infection negatively affect the expression of DDC, while DDC negatively affects viral replication. The negative correlation between HCV RNA and DDC mRNA was confirmed in liver biopsies from patients with chronic HCV infection. Overall, broadly effective inhibitors targeting Flaviviridae viruses were detected, which could be developed as antivirals, or against co-infections and emerging viruses. In addition, factors regulated by hypoxia and PI3K/AKT pathways were found to play an important role in the replication of Flaviviridae viruses, such as HIF (DENV) and DDC (HCV, DENV), which could be used as antiviral targets, or biomarkers of disease progression.

Παρά τις αποτελεσματικές θεραπείες έναντι του ιού της Ηπατίτιδας C (HCV), παραμένουν ακόμη προβλήματα, όπως το υψηλό κόστος, η εμφάνιση ανθεκτικότητας και οι συμμολύνσεις με τον ιό της Ηπατίτιδας Β (HBV) και τους συγγενικούς στον HCV ιοί Δάγκειος (DENV), Κίτρινου πυρετού (YFV) και Ζίκα (ZIKV). Ακόμη, είναι πολλά άγνωστα για τους κυτταρικούς μηχανισμούς ρύθμισης της ιικής αντιγραφής. Επομένως, στα πλαίσια της εργασίας αυτής μελετήθηκαν α) νέοι αναστολείς έναντι ιών της οικογένειας Flaviviridae (HCV, DENV, YFV, ZIKV) και ο μηχανισμός δράσης τους, και β) η σημασία κυτταρικών παραγόντων στην ιική αντιγραφή και παθογένεια για την ανάδειξη νέων βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων έναντι των ιών Flaviviridae, εστιάζοντας στα σηματοδοτικά μονοπάτια υποξίας, PI3K/ΑΚΤ και στην αποκαρβοξυλάση της L-Dopa (DDC) η οποία εντοπίσαμε να προσδένεται στην PI3K. Για τον πρώτο στόχο, ελέγχθηκαν έναντι των ιών Flaviviridae: 1) φυτικά εκχυλίσματα και απομονωμένες ενώσεις, 2) νουκλεοσιδικά και πεπτιδομιμητικά συνθετικά ανάλογα, βασισμένα σε εγκεκριμένους αντι-HCV αναστολείς, και 3) ανάλογα Ν-υδροξυϊμιδίου και ακετοϋδροξαμικού οξέος, που δεσμεύουν χηλικά δισθενή μεταλλοϊόντα στο ενεργό κέντρο ιικών ενζύμων. Συγκεκριμένα, βρέθηκαν φυτικές ενώσεις με ευρεία αντι-ιική δράση, ενώ το φλαβονοειδές 2’-υδροξυγενιστεΐνη-7-O-γλυκοπυρανοσίδιο, ήταν αποτελεσματικό έναντι του DENV (μέση δραστική συγκέντρωση-EC50=6,38 μΜ. Το νουκλεοσιδικό ανάλογο 15d ανέστειλε τον HCV 1b (EC50=40,22 μΜ), με υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Οι μεταλλαγές ανθεκτικότητας υποδεικνύουν πως αναστέλλει αλληλεπιδράσεις της NS5A. Το Ν-υδροξυμίδιo ZF66 είχε EC50=3,08 μΜ έναντι του HCV 1b, με υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, και πιθανά προσδένεται χηλικά στο ενεργό κέντρο της NS5B πολυμεράσης. Τέλος, τα ακετοϋδροξαμικά ανάλογα με υποκαταστάτη αδαμαντάνη, έχουν ευρεία δράση έναντι των HCV, DENV, YFV και ZIKV, με δραστικότερα τα ΖΒ5 (HCV 1b: EC50=0,08 μΜ) και ΖΡ64 (DENV: EC50=0,07 μΜ), παρουσιάζουν υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας και πιθανόν στοχεύουν την ιική πρωτεΐνη NS3. Για τον δεύτερο στόχο, δείχθηκε πως η υποξία (3% v/v Ο2) αυξάνει την RNA αντιγραφή του DENV, μέσω παραγόντων που ενεργοποιούνται στο χαμηλό οξυγόνο, όπως oι ΗΙF και AKT, αλλά όχι η PI3K. Επιπλέον, μειώνει τη δράση αναστολέων των HCV και DENV. Αντίστροφα, ο DENV επάγει τον HIF στο ατμοσφαιρικό οξυγόνο, προκαλώντας προς ώφελός του έναν μεταβολικό επαναπρογραμματισμό στο κύτταρο-ξενιστή. Επιπλέον, η μόλυνση από DENV και HCV επηρεάζει αρνητικά την έκφραση της DDC, ενώ η DDC επηρεάζει αρνητικά την ιική αντιγραφή. H αρνητική συσχέτιση μεταξύ HCV RNA και mRNA της DDC επιβεβαιώθηκε σε ηπατικές βιοψίες ασθενών με χρόνια HCV μόλυνση. Συνολικά, βρέθηκαν αναστολείς με ευρεία δράση έναντι των ιών Flaviviridae, που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως αντι-ιικά φάρμακα, καθώς και για την αντιμετώπιση συλλοιμώξεων ή αναδυόμενων ιών. Επιπλέον, βρέθηκαν παράγοντες που ρυθμίζονται από τα μονοπάτια υποξίας και PI3K/AKT και παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιγραφή των ιών Flaviviridae, όπως οι HIF (DENV) και DDC (HCV, DENV), που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως αντι-ιικοί στόχοι, ή βιοδείκτες της εξέλιξης της νόσου.