Μελέτη της τροποποίησης της σηματοδότησης των MAPKs - ERKs παρουσία των HCV δομικών πρωτεϊνών

Abstract

An estimated 3% of the world population is infected by hepatitis C (HCV). HCV is an enveloped positive-strand RNA virus, with a genome of approximately 9.600 nucleotides, encoding for structural (Core, E1, E2, p7) and non-structural (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) proteins. In most infected individuals, this virus evades the immune system and establishes a chronic infection that can progress to cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV proteins are involved in the development of hepatocellular carcinoma as they modulate MAPK signalling pathway. It has been proposed that capsids from a number of viruses like the Ebola virus, can produce signalling events. The HCV nucleocapsid is surrounded by a lipid layer containing glycoproteins E1 and E2. However, different forms of HCV particles may exist in the circulation of infected individuals and among them naked capsids have also been reported. Furthermore, novel HCV subgenomes with in-frame deletions of both envelope proteins (E1 and E2), were identified in the liver, as well as in the serum of HCV infected individuals. Recently Tsitoura et al. reported the generation of recombinant non-enveloped HCV core particles in the absence of other HCV proteins. More importantly, this report demonstrated that these naked capsids can be taken up by cells and induce cell-signalling phenomena. Based on the previous, we aimed in developing a strategy for the labelling of the HCV non-enveloped capsids by using the enhanced green fluorescent protein (GFP). GFP has been fused to a great number of proteins in order to study their intracellular trafficking and localization. We used the baculovirus expression system to generate recombinant fluorescent non-enveloped capsid-like particles (fluorescent HCVne) that possess identical properties to the one already described. The chimeric proteins core₁₇₃-GFP, GFP-core₁₉₁ and GFP- core₁₇₃ produced can be efficiently expressed and self assembled to form fluorescent non-enveloped capsid-like particles that can efficiently be taken up by human cells. In addition, we observed the trafficking of these fluorescent HCVne particles in live-microscopy, providing evidence of an attractive tool for viral tracking. To understand the biological significance of naked HCVne particles, we investigated the mechanism of entry of these particles. Recent studies have revealed a surprising variety of endocytic routes for enveloped as well as non-enveloped viral capsids including clathrin-mediated and caveolin-mediated endocytosis. Hepatitis C enveloped particles use the clathrin-mediated endocytosis, but to our knowledge no information about the entry mechanism of ΗCV non-enveloped particles exist. Data presented here, suggest that HCVne particles penetrate into hepatic cells via pH dependent clathrin-mediated endocytosis. During this process different MAPK pathways become activated. Entry process starts with the attachment of HCVne particles at the cell surface which is followed by a clathrin-mediated internalization, and localization of particles to early endosomes. Internalization occurs relatively fast, with the majority of entering viral particles internalized in early endosomes between 9 to 15 minutes During the endocytosis of the particles from the cellular surface to early endosome the pH changes in endosomes seem to be implicated. In addition, phosphorylated proteins and particularly tyrosine phosphoproteins, as well as MAPK-p38 protein are shown to be important during this trafficking. After entering early endosomes, HCVne particles moved along from endosomal to lysosomal compartments, through involvement of microtubules network. Data presented here shows a colocalization of HCVne particles with late endosomes at 1 hour post incubation reaching maximum colocalization with lysosomes at 4 hours. During early endosome-lysosome transport, different phosphorylated proteins are showed to be essential, such proteins are the serine/threonine and tyrosine phosphoproteins, as well as phospho-ERK₁/₂ and possibly phospho-p38. Previously described data showed specific ERF translocation from the nucleus to the cytoplasm after HCVne particles uptake, suggesting a possible activation of ERK₁/₂ pathway. In this report we described that ERK₁/₂ present a maximum activation 30 min after internalization that disappears when cells are treated with specific MEK₁/₂ inhibitors and is shown to be endocytosis-dependent. In addition, HCVne particles endocytosis produce a sustained ERK₁/₂ activation and a nuclear ERK₁/₂ accumulation. Magnitude and duration of ERK₁/₂ phosphorylation is important for the immediate early genes (IEG) promoter activation as well as for the stability of the produced proteins. In this study we show an increased activation of IEG c-fos and egr-1, totally or partially attributed to the ERK₁/₂ pathway. This constitutes an interesting observation as c-fos and egr-1 has been found to be overexpressed with high frequency in aggressive and invasive hepatocarcinomas making these genes an important target for putative therapy. We have also investigated another important signalling molecule of the MAPK pathway, the ERK5. ERK5, also known as BMK1, is a MAPK that presents approximately 80% of similarities with ERK₁/₂. This kinase contains the typical ERK phosphorylation motif (TEY) and a unique C-terminal region that is believed to be responsible for its distinct biological activities. ERK5 activity is increased in response to growth factors, oxidative stress and hyperosmolarity, via a direct phosphorylation by MEK5. It is important to note that ERK5 has been implicated in different types of cancers and angiogenesis. We were able to show that ERK5 can be activated by HCVne particles, via MEK5 protein, but not from endogenously expressed core or NS5A proteins. In addition, a well known downstream target of this pathway, mef2 also seems to be affected. Although our knowledge about HCV mechanism of entry, replication and infectivity are progressing a great number of aspects are still left unanswered. The evaluation of the impact of cellular environmental modifications produced by signalling events similar to those produced by the endocytotic properties of naturally occurring HCVne could potentially be of major importance for HCV life cycle and severity of the disease.

Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) ταυτοποιήθηκε το 1989 και υπάρχουν παγκοσμίως περίπου 170 εκατομμύρια φορείς του ιού. Ποσοστό που κυμαίνεται στο 80 με 85% καταλήγει σε χρόνια ηπατίτιδα και από αυτούς, το 20% αναπτύσσει κίρρωση του ήπατος. Ετησίως το 3- 5% των κιρρωτικών ασθενών καταλήγει σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Η θεραπεία βασίζεται στην ταυτόχρονη χορήγηση πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης-α και ριμπαβιρίνης, αλλά ποσοστό μεγαλύτερο από το 50% των ασθενών δεν ανταποκρίνεται στη θεραπεία. Ο HCV ανήκει στο γένος των Hepacivirus, στην οικογένεια των φλαβιιών (flaviviridae). Το ιικό του γονιδίωμα συνίσταται σε ένα μονόκλωνο, θετικής πολικότητας RNA μόριο μήκους 9,6 Kb το οποίο κωδικοποιεί μια πολυπρωτεΐνη μήκους περίπου 3000 αμινοξέων η οποία πρωτεολύεται με την βοήθεια κυτταρικών και ιικών πρωτεασών σε τουλάχιστον τρία δομικά (core, E1, E2) και επτά μη δομικά πολυπεπτίδια (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Από αυτές τις πρωτεΐνες η core είναι υπεύθυνη, μεταξύ άλλων, για την δημιουργία του καψιδίου, ενώ οι πρωτεΐνες Ε1 και Ε2 σχηματίζουν τον φάκελο του ιού. Στον ορό των ασθενών είναι κοινώς αποδεκτή η ύπαρξη καψιδίων όχι μόνο με φάκελο αλλά και χωρίς, των οποίων ο ρόλος παραμένει ακόμα αδιευκρίνιστος. Η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε στην κατασκευή ανασυνδυασμένων βακουλοϊών, μέσω των οποίων επιτεύχθηκε απομόνωση γυμνών core καψιδίων με ή χωρίς την ιδιότητα του φθορισμού. Ακολούθησε λεπτομερής μελέτη για τον χαρακτηρισμό των κατασκευασθέντων καψιδίων με την οποία αποδείχτηκε η λειτουργικότητα τους. Στη συνέχεια μελετήθηκε ο τρόπος εισόδου τους σε κύτταρα, κυρίως ηπατικής προέλευσης, και αποδείχτηκε ότι τα καψίδια χρησιμοποιούν την ενδοκύτωση μέσω κλαθρίνης για να εισχωρήσουν στο κύτταρο-ξενιστή και να φτάσουν στα πρώιμα και όψιμα ενδοσώματα και τελικά στα λυσοσώματα. Επιπλέον, αποδείχτηκε πως κατά την διάρκεια της συγκεκριμένης πορείας εμπλέκονται το χαμηλό pH, οι καθεψίνες B και L καθώς και διάφορες φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες όπως η p38, οι ERK₁/₂ και διαφόρων ειδών φωσφατάσες. Στη συνέχεια, τα γυμνά core καψίδια που απομονώθηκαν επωάστηκαν εξωγενώς με διάφορα είδη κυττάρων και μελετήθηκε η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MAPKs και ειδικότερα τα μονοπάτια των ERK₁/₂ και ERK5. Παρατηρήθηκε πως ενεργοποιούν και τα δυο μονοπάτια, φωσφορυλιώνοντας τις ανάλογες πρωτεΐνες, μετά από επώαση τριάντα λεπτών. Το φαινόμενο αυτό είναι ποσοτικά εξαρτώμενο ενώ οι μάρτυρες που χρησιμοποιήθηκαν δεν εμφάνισαν καμία ενεργοποίηση. Με τη χρήση διαλυτής core ή GFP πρωτεΐνης, ακόμα και σε μεγάλες συγκεντρώσεις, καθώς και με τη χρήση διαφόρων χημικών αναστολέων, δεν ενεργοποιήθηκε κανένα από τα δύο μονοπάτια υποδηλώνοντας τη σημασία της καψιδιακής δομής και της διαδικασίας εισόδου του καψιδίου. Ακολούθησε, μελέτη για τον κυτταρικό εντοπισμό των ERK₁/₂ και ERK5 φωσφο-πρωτεϊνών, καθώς και της ιδιότητας ενεργοποίησης χαρακτηριστικών καθοδικών στόχων. Τα core καψίδια προκαλούν την πυρηνική μετατόπιση των ERK₁/₂ πρωτεϊνών, επηρεάζοντας τη μεταγραφή των γονιδίων πρώιμης απόκρισης c-fos και egr-1. Επιπλέον, αποδείχτηκε πως η παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού οδηγούσε στην σταθεροποίηση της πρωτεΐνης c-Fos. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε πυρηνική μετακίνηση ή παρατεταμένη φωσφορυλίωση της ERK5 πρωτεΐνης, και επομένως η παρατηρούμενη ενεργοποίηση του γονιδίου mef2, γνωστού καθοδικού στόχου του μονοπατιού, φαίνεται να επιτυγχάνεται με έμμεσο τρόπο. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων στο σύνολό τους αποτελούν σημαντική συμβολή στην κατανόηση των μηχανισμών παθογένειας που είναι πιθανό να διέπουν την λοίμωξη από τον ιό.